雷公藤甲素减轻MRL/lpr狼疮小鼠肾损伤的作用机制研究

段然，吴沅皞，刘维

（天津中医药大学第一附属医院 风湿免疫科，天津300193）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是临床常见的自身免疫性疾病，以自身免疫应答紊乱、产生自身抗体异常并与相应自身抗原形成免疫复合物为特征，可累及全身多个脏器并引起相应的临床表现[1]。肾脏是SLE 病情发展变化过程中常见的受累脏器，免疫复合物在肾脏沉积后引起狼疮肾炎（lupus nephritis,LN），LN 不仅是影响SLE 预后的重要因素，也是引起终末期肾脏病的常见原因，需要进行积极防治[2-3]。雷公藤甲素（Triptolide,TPL）是从中药雷公藤中提取到的环氧化二萜内酯化合物，具有免疫调节活性，在SLE、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗中体现出一定价值[4]，多项研究报道了TPL 对SLE 小鼠肾功能的保护作用[5-6]，但具体的机制并未阐明。国内施栋梁等[7]关于SLE 的细胞实验证实，TPL 对γ 干扰素（Interferon-gamma,IFN-γ）诱导的肾小球细胞炎症具有缓解作用，且这一作用与抑制JAK1/STAT1 信号通路有关。基于此，本实验深入探究TPL 调控JAK1/STAT1 通路，减轻MRL/lpr狼疮小鼠肾损伤的作用及机制，旨在阐明TPL 用于LN防治的潜在价值及分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性C57BL/6 正常小鼠8 只及MRL/lpr 狼疮小鼠32 只购自苏州赛业模式生物研究中心，8～10 周龄、体重20～25 g。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0003。

1.2 实验试剂与仪器

TPL 购自上海柘智生物科技公司，过表达JAK1 的腺病毒购自上海汉恒生物科技公司（浓度1×1011PFU/ml、-80℃保存），尿蛋白、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea,BUN）检测试剂盒购自南京建成研究所，免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，IgG、C3 抗体购自美国Abcam 公司，HE 染色试剂盒购、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司，γ 干扰素诱导蛋白-10（interferon-gamma induced protein 10, IP-10）、高迁移率族蛋白1（high mobility group box protein 1, HMGB1）酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒购自上海酶联公司，JAK1、STAT1一抗购自德国CST 公司。正置显微镜购自日本Nikon 公司，多功能酶标仪购自美国Bio Tek 公司，电泳仪及凝胶成像仪购自上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组、模型复制及给药8 只C57BL/6 正常小鼠作为对照组；32只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为模型组、TPL 组、JAK1 组、TPL+JAK1 组，每组8只。模型组给予生理盐水灌胃，连续9周；TPL 组给予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，连续9 周；JAK1 组给予JAK1 腺病毒悬液10 μl 单次尾静脉注射；TPL+JAK1 组给予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，连续9周，以及JAK1腺病毒悬液10 μl单次尾静脉注射。

1.3.2 尿蛋白及Scr、BUN 的检测末次灌胃后开始收集24 h 尿，然后处死小鼠收集血清，检测24 h尿蛋白及Scr、BUN 水平，按照试剂盒说明书进行操作，配置反应体系后在全自动生化分析仪上检测相应指标。

1.3.3 肾脏HE染色及免疫荧光染色处死小鼠后解剖双侧肾脏，左侧肾脏用4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，制作病理切片后行HE 染色，在显微镜下观察肾脏的病理改变；另取肾脏病理切片行免疫荧光染色，IgG 和C3 一抗的稀释比例为1∶300，染色后用抗荧光猝灭封片液封片，显微镜下观察并计算免疫荧光强度。以上操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 血清及肾脏中IP-10、HMGB1 质量分数的检测取血清样本，采用ELISA 试剂盒检测IP-10、HMGB1 质量分数。取右侧肾脏组织，采用ELISA 试剂盒检测IP-10、HMGB1 质量分数，计算每毫克肾脏蛋白对应的IP-10、HMGB1 含量。以上操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 肾脏中JAK1、STAT1表达水平的检测取右侧肾脏组织，用RIPA 裂解液提取组织中的蛋白，将30 μg 蛋白样本加入SDS-PAGE 电泳后湿转至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭NC 膜1 h，用1∶2 000稀释的JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 一抗4℃孵育过夜；次日，洗膜3 遍后室温孵育二抗1h，再次洗膜3 遍，采用BCA 试剂盒检测蛋白。在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带，用Image J 图像处理软件对条带进行灰度值分析，根据灰度值计算蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平

各组小鼠24 h 尿蛋白及Scr、BUN 比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组较对照组高（P<0.05），TPL 组较模型组低（P<0.05），JAK1 组较模型组高（P<0.05），TPL+JAK1组较TPL 组高（P<0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠肾脏病理变化

对照组小鼠肾脏大致正常，未出现明显的病理变化；模型组肾小球毛细血管损伤，炎症细胞浸润明显；TPL 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较模型组减轻，JAK1 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较模型组加重；TPL+JAK1 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较TPL 组减轻。见图1。

表1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比较 （n=8，±s）

表1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与TPL组比较，P<0.05。

组别24 h尿蛋白/mg Scr/（μmol/L）BUN/（mmol/L）对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F值P值5.84±0.94 23.32±5.58①10.32±2.52②28.93±6.72②19.29±3.48③37.142 0.000 32.12±6.68 79.49±13.48①45.68±10.23②94.51±14.27②74.51±12.84③37.037 0.000 10.38±2.35 35.75±8.49①17.68±4.51②42.49±9.24②33.24±8.68③27.619 0.000

图1 各组小鼠肾脏病理变化 （HE染色×200）

2.3 各组小鼠肾脏IgG及C3的免疫荧光强度比较

各组小鼠肾脏IgG 及C3 免疫荧光强度比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组较对照组高（P<0.05），TPL 组较模型组低（P<0.05），JAK1 组较模型组高（P<0.05），TPL+JAK1组较TPL 组高（P<0.05）。见表2 和图2、3。

2.4 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数

各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组较对照组高（P<0.05），TPL 组较模型组低（P<0.05），JAK1 组较模型组高（P<0.05），TPL+JAK1 组较TPL 组高（P<0.05）。见表3。

2.5 各组小鼠肾脏中JAK1、STAT1蛋白相对表达量

各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组较对照组高（P<0.05），TPL 组较模型组低（P<0.05），JAK1 组较模型组高（P<0.05），TPL+JAK1 组较TPL 组高（P<0.05）。见表4和图4。

表2 各组小鼠肾脏IgG和C3的荧光强度比较 （n=8，±s）

表2 各组小鼠肾脏IgG和C3的荧光强度比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与TPL组比较，P<0.05。

组别C3 IgG对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值0.89±0.18 6.29±1.07①1.88±0.35②8.04±1.22②5.77±0.86③105.498 0.000 1.02±0.24 6.68±0.94①2.21±0.45②8.20±1.32②5.96±1.02③95.341 0.000

图2 各组小鼠肾脏IgG的荧光强度 （免疫荧光染色×400）

图3 各组小鼠肾脏C3的荧光强度 （免疫荧光染色×400）

表3 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1的质量分数比较 （n=8，pg/mg，±s）

表3 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1的质量分数比较 （n=8，pg/mg，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与TPL组比较，P<0.05。

血清肾脏组别对照组HMGB1 2.77±0.52 IP-10 8.39±1.32 HMGB1 20.38±5.58 IP-10 1.84±0.35模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值8.21±1.32①4.02±0.77②11.28±1.94②8.33±1.42③57.591 0.000 26.58±4.52①13.47±2.44②34.28±7.69②24.57±5.56③36.801 0.000 65.85±12.12①31.38±8.38②80.28±15.52②59.49±11.74③39.418 0.000 5.58±0.89①3.02±0.65②7.35±1.24②5.34±0.81③54.325 0.000

表4 各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1蛋白相对表达量比较 （n=8，±s）

表4 各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1蛋白相对表达量比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与TPL组比较，P<0.05。

组别p-JAK1 p-STAT1对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值0.45±0.08 0.78±0.14①0.54±0.10②1.08±0.16②0.84±0.17③27.766 0.000 0.67±0.11 0.83±0.16①0.54±0.08②1.14±0.22②0.79±0.13③18.366 0.000

图4 各组小鼠肾脏JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白的表达

3 讨论

肾脏是SLE 常见的受累脏器，肾脏局部补体过度激活、炎症细胞因子异常分泌、免疫复合物沉积是引起肾脏损伤的主要病理因素[8-10]。在临床实践中，LN 是造成SLE 预后不良的危险因素，也是终末期肾脏病的常见病因，在SLE 的病情发展变化过程中对肾损伤进行积极防治具有积极的临床意义[11-13]。

目前，临床上治疗SLE 的主要药物包括糖皮质激素、羟氯喹、环磷酰胺等，起效迅速但毒副反应相对较多，并且缺乏治疗LN 的有效药物。雷公藤是具有清热解毒、祛风通络作用的中药，TPL是雷公藤中重要的活性成分，已被证实能够用于SLE、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的治疗[14-15]，也有研究报道TPL 在肾小球肾炎治疗中的价值[16-17]。近些年，陆续有国内学者报道了TPL 在肾脏疾病治疗中的价值，秦登优等[5]和刘玉芳等[6]的研究分别以MRL/lpr 狼疮小鼠和Pristane 诱导的狼疮小鼠为研究对象，给予TPL 灌胃后观察到小鼠的肾损伤明显改善。本实验参照秦登优等[5]的研究，使用MRL/lpr 狼疮小鼠进行研究，并给予TPL 灌胃干预，通过生化指标及肾脏病理改变、免疫荧光染色结果发现24 h 尿蛋白、Scr、BUN 减少，肾脏病理改变减轻，IgG 及C3 的荧光强度减弱，表明TPL 干预使MRL/lpr 狼疮小鼠的肾损伤减轻，表现为肾功能的改善、局部免疫复合物及补体沉积的减少，这与既往关于TPL 改善狼疮小鼠肾功能的报道一致[5-6]，提示TPL 可能在LN 防治中具有积极作用。

虽然越来越多的研究证实TPL 在SLE、LN 治疗中的价值，但是其分子机制尚不十分清楚。肾小球系膜是LN 病理损伤主要累及的部位，施栋梁等[7]、陈砚凝等[18]及XU 等[19]以肾小球系膜细胞为研究对象进行了细胞实验，通过IFN-γ刺激的方式模拟SLE发病过程中肾损伤的病理特征，观察到细胞中JAK1/STAT1 通路过度激活、下游促炎细胞因子IP-10 及HMGB1 的表达增加，IP-10、HMGB1 能够在局部招募免疫细胞，引起免疫应答紊乱，促进免疫复合物沉积，进而造成肾损害的发生。由此推测，JAK1/STAT1通路激活后IP-10、HMGB1表达增加可能参与SLE发病过程中的肾损害。而在IFN-γ刺激的同时予以TPL 干预后，JAK1/STAT1 通路的激活及下游IP-10、HMGB1 的表达均受到抑制，由此提示TPL 对JAK1/STAT1 通路的激活具有抑制作用，这也可能是TPL发挥治疗作用的分子机制。

LN 相关的动物实验表明，LN 动物肾脏中JAK1/STAT1 通路活化[20-22]，抑制该通路能够减轻LN 的肾损害[23]。本实验在阐明TPL对狼疮小鼠肾功能的改善作用后，进一步分析了JAK1/STAT1 通路在TPL 改善肾功能中的作用。狼疮小鼠血清、肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数及肾脏中p-JAK1、p-STAT1 的表达水平均明显升高，表明狼疮小鼠肾组织JAK1/STAT1通路过度激活，与IFN-γ刺激后肾小球系膜细胞中JAK1/STAT1 通路过度激活的趋势一致；采用TPL 对狼疮小鼠进行干预后，血清、肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数及肾脏中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相对表达量均明显降低，表明TPL 能够抑制狼疮小鼠肾脏中JAK1/STAT1 通路的激活，这可能是TPL 减轻肾损伤的分子机制。为了进一步验证这一机制，本实验设计了过表达JAK1 的腺病毒，尾静脉注射腺病毒后进行TPL干预，结果发现TPL减轻肾损伤、减少免疫复合物及补体沉积、降低IP-10 及HMGB1 的作用明显被削弱，由此证实抑制JAK1/STAT1 通路是TPL 减轻狼疮小鼠肾损伤的分子机制，TPL 能够通过抑制JAK1/STAT1减轻狼疮小鼠肾脏的病理改变。

综上所述，TPL 减轻MRL/lpr 狼疮小鼠肾损伤的分子机制可能是抑制JAK1/STAT1 通路介导的炎症反应，未来TPL 有望成为治疗SLE、预防LN 的候选药物。