痹祺胶囊治疗胶原诱导型关节炎大鼠的作用机制研究

张冬梅，李宝丽

痹祺胶囊治疗胶原诱导型关节炎大鼠的作用机制研究

张冬梅1，李宝丽2*

1. 天津市中医药研究院附属医院糖尿病科，天津 300131 2. 天津医科大学总医院 中医科，天津 300052

探究痹祺胶囊对胶原诱导型关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠中软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）表达的影响。随机选取10只SD大鼠作为对照组，其余大鼠建立CIA模型，CIA大鼠随机分为模型组，痹祺胶囊中、高剂量（0.6、0.9 g/kg）组，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg）组，连续给药4周，观察大鼠的一般情况和足肿胀变化，检测大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表达、软骨中COMP mRNA表达。与对照组比较，模型组大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表达、软骨中COMP mRNA表达均显著升高（＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表达、软骨中COMP mRNA表达均显著降低（＜0.001）。痹祺胶囊可能通过下调COMP表达，抑制炎性细胞浸润、滑膜增生和关节软骨破坏，从而治疗类风湿关节炎。

痹祺胶囊；类风湿关节炎；软骨寡聚基质蛋白；胶原诱导型关节炎；滑膜

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性关节疾病，其病理特征为炎性细胞浸润、关节滑膜增生，伴随关节软骨及软骨下骨进行性损伤，最终导致关节功能障碍，甚至出现畸形，因此RA的早期诊断治疗至关重要[1-3]。胶原诱导型关节炎（collagen induced arthritis，CIA）动物模型的临床症状和病理表现与RA极为相似，为研究RA常用的动物模型。软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）是一种细胞外基质蛋白，主要位于肌腱、软骨和软骨周组织。研究表明，COMP既能用于RA的早期诊断，又能用于判断关节损伤情况[4]。本研究旨在探讨痹祺胶囊对CIA大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表达和软骨中COMP mRNA表达的影响，为痹祺胶囊治疗RA的作用机制提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雌性SD大鼠50只，4周龄，体质量（150±10）g，购自天津军事科学院，合格证号0002257。动物于中国医学科学院生物医学工程研究所，温度23～25 ℃，湿度（50±5）%，适应性饲养1周。动物实验遵循中国医学科学院生物医学工程研究所实验动物管理规定，符合3R原则。

1.2 药品与试剂

甲氨蝶呤（2.5 mg/片，批号20100302）购自上海医药有限公司信谊制药总厂；痹祺胶囊（国药准字Z10910026，批号311345，规格0.3 g/粒）购自天津达仁堂京万红药业有限公司；牛Ⅱ型冻干胶原、不完全弗式佐剂，购自美国Chondrex公司；COMP ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥有限公司；qRT-RCR试剂和COMP、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列均购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.3 仪器

YLS-7B足趾容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；XSP-300型双目显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；DG5032型酶联免疫检测仪（南京市华东电子团体医疗装备有限责任公司）；CFX96型荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；恒温离心机（江苏省盐城市凯特实验仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分组与给药

牛Ⅱ型冻干胶原溶于乙酸，按1∶1与不完全弗式佐剂混匀制成乳剂。随机选取10只SD大鼠作为对照组，其余大鼠尾根部sc 0.2 mL乳剂，第2周再次注射0.1 mL乳剂，对照组注射等体积生理盐水。第3周将造模大鼠按足肿胀程度随机分为模型组，痹祺胶囊中、高剂量（0.6、0.9 g/kg，相当于临床剂量的10、15倍）组，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg，相当于临床剂量的10倍）组，每组10只。痹祺胶囊溶于生理盐水分别配制成质量浓度为0.06、0.09 g/mL的溶液，甲氨蝶呤溶于生理盐水配制成质量浓度为0.167 mg/mL的溶液。痹祺胶囊组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积生理盐水，1次/d；甲氨蝶呤组ig相应药物，1次/周，连续4周。用足趾容积测定仪测定大鼠后足体积，每2天1次，计算大鼠足肿胀率。

足肿胀率＝(隔日大鼠后足体积－第1天大鼠后足体积)/第1天大鼠后足体积

2.2 痹祺胶囊对RA大鼠血清COMP水平的影响

各组大鼠脱颈椎处死，腹主动脉取血后分离血清，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中COMP水平。

2.3 痹祺胶囊对RA大鼠滑膜COMP蛋白表达的影响

取各组大鼠左侧踝关节，按照SP试剂盒和DAB显色试剂盒说明书进行切片显色后，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片，于显微镜下观察滑膜COMP阳性细胞并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性蛋白含量变化。

2.4 痹祺胶囊对RA大鼠软骨中COMP mRNA表达的影响

取各组大鼠左侧踝关节，按照Trizol试剂说明书提取大鼠软骨总RNA，测定其质量浓度后，逆转录合成cDNA，进行qRT-RCR分析。引物序列：COMP上游引物为5’-GAGAACTTTGCCGTTGAA- GC-3’，下游引物为5’-GCTTCCTGTAGGTGGCAA- TC-3’；GAPDH上游引物为5’-CAGGGCTGCCTTC- TCTTGTG-3’，下游引物为5’-GATGGTGATGGGT- TTCCCGT-3’。qRT-RCR程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35次循环后延伸7 min。

2.5 统计分析

3 结果

3.1 痹祺胶囊对RA大鼠一般情况的影响

模型组大鼠精神萎靡、毛色晦黯、体质量增长迟缓、饮食减少、行动迟缓；各给药组大鼠精神状态、体质量、毛色、饮食、行走步态均较模型组有所缓解。

3.2 痹祺胶囊对RA大鼠足肿胀率的影响

如图1所示，造模2周内，模型组大鼠足肿胀率升高，第15～23天给药组大鼠足肿胀率降低，第24天给药组较模型组大鼠足肿胀率降低。

3.3 痹祺胶囊对RA大鼠血清COMP水平的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中COMP水平显著升高（＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中COMP水平显著降低（＜0.001）。

图1 痹祺胶囊对RA大鼠足肿胀率的影响()

表1 痹祺胶囊对RA大鼠血清COMP水平的影响()

与对照组比较：***＜0.001；与模型组比较：###＜0.001，下表同

***< 0.001control group;###< 0.001model group, same as blow table

3.4 痹祺胶囊对RA大鼠滑膜COMP蛋白表达的影响

如图2和表2所示，对照组滑膜未见COMP表达；与对照组比较，模型组滑膜可见大量阳性细胞，COMP蛋白表达显著升高（＜0.001）；与模型组比较，各给药组滑膜可见部分阳性细胞，COMP蛋白表达显著降低（＜0.001）。

图2 痹祺胶囊对RA大鼠滑膜中COMP蛋白表达的影响(×400)

表2 痹祺胶囊对RA大鼠滑膜COMP蛋白表达的影响()

3.5 痹祺胶囊对RA大鼠软骨中COMP mRNA表达的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠软骨中COMP mRNA表达显著升高（＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠软骨中COMP mRNA表达显著降低（＜0.001）。

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：###P＜0.001

4 讨论

RA是一种不可逆转的自身免疫性疾病，其治疗原则为抗炎、镇痛、抑制关节破坏。目前临床上用于治疗RA的药物多为非甾体抗炎药、皮质类固醇、抗风湿药、生物制剂等，具有骨丢失、肝衰竭、呼吸衰竭等不良反应[5-6]。甲氨蝶呤是RA治疗的首选药物，可选择性作用于细胞S期，干扰细胞DNA的合成，抑制滑膜细胞增殖，发挥抗炎作用，并可阻止滑膜侵袭软骨及骨，延缓RA的病程进展[7]。然而，长期服用甲氨蝶呤具有肝毒性、肿瘤抑制等严重不良反应，可致胎儿畸形[8]。因此开发一种不良反应小、便于长期服用的药物对治疗RA有重要意义。

痹祺胶囊是治疗RA的常用中药制剂，由三七、马钱子、党参、白术、丹参、川芎、甘草等药物组成，全方具有散寒除湿、活血通络的功效，经多年临床使用证实对RA有确切疗效。痹祺胶囊对CIA大鼠后足肿胀度、关节炎指数和疼痛有明显改善作用，可抑制CIA大鼠的原发性、继发性损害，可通过下调白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表达，上调骨保护素表达，干预慢性滑膜炎症、血管翳形成、软骨及骨的破坏[9-12]。现代药理学研究表明，马钱子可抑制成纤维样滑膜细胞的增殖，丹参可促进成纤维样滑膜细胞凋亡并抑制其侵袭，从而抑制滑膜增生及血管翳的形成[13]。

COMP是RA诊断和预后的标志物。RA早期患者血清中COMP水平升高，滑膜COMP表达水平可用于观察软骨破坏及关节疾病预后[14]。Carlsen等[15]发现COMP诱导的关节炎模型依赖于由T细胞识别、呈递分子的相容性复合体，而T细胞可促进炎症因子及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）产生，破坏软骨代谢。本研究结果显示，模型组血清中COMP水平、滑膜中COMP表达均显著升高，提示CIA模型成功建立。研究发现，RA患者血清中COMP水平与疾病活动评分和软骨破坏显著相关[16]。本研究结果显示，模型组大鼠软骨中COMP mRNA表达显著升高，提示COMP可能通过诱导MMPs的产生从而破坏软骨；各剂量痹祺胶囊组血清中COMP水平、滑膜中COMP表达和软骨中COMP mRNA水平均显著降低，与甲氨蝶呤疗效相当。

综上所述，痹祺胶囊可能通过下调血清中COMP水平、滑膜和软骨中COMP表达，抑制炎性浸润、滑膜增生和关节破坏，从而发挥保护关节软骨的作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on mechanism of Biqi Capsule in treating collagen induced arthritis rats

ZHANG Dong-mei1, LI Bao-li2

1. Affiliated Hospital of Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300120, China 2. General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

To investigate the effect of Biqi Capsule (痹祺胶囊) on the expression of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in CIA rats.A total of 10 rats were randomly selected as control group, the other rats were used to establish CIA model, CIA rats were randomly divided into model group, low-, medium-dose Biqi Capsule (0.6, 0.9 g/kg) groups and methotrexate (1.67 mg/kg) group. After administration for 4 weeks, the changes of paw swelling in rat were observed; The level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were tested.Compared with control group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were significantly increased in model group (< 0.001); Compared with model group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were decreased in treatment groups (< 0.001).Biqi Capsule may prevent inflammatory infiltration, synoviocyte proliferation, cartilage destruction by inhibiting the expression of COMP, and then treat rheumatoid arthritis.

Biqi Capsule; rheumatoid arthritis; cartilage oligomeric matrix protein; collagen-induced arthritis; synovium

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1059 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.019

2020-11-10

张冬梅，医学硕士，从事风湿免疫、内分泌的临床与药理学研究。E-mail: 13516268238@163.com

李宝丽，硕士研究生导师，主任医师，从事风湿免疫方向研究。E-mail: li3106@sina.com

[责任编辑 李亚楠]