基于传统煎药工艺的黄芪药材HPLC指纹图谱及化学计量学质量评价研究

张 倩，杨怀瑾，周 悦，余亦婷，庄欣雅，毛春芹，谢 辉，李 林，陆兔林，严国俊*

基于传统煎药工艺的黄芪药材HPLC指纹图谱及化学计量学质量评价研究

张 倩1，杨怀瑾2，周 悦1，余亦婷1，庄欣雅1，毛春芹1，谢 辉1，李 林1，陆兔林1，严国俊1*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 南京市莫愁中等专业学校，江苏 南京 210017

基于传统煎药工艺建立不同产地黄芪的HPLC指纹图谱，用于黄芪药材质量的评价。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）对15批不同产地的黄芪药材的HPLC指纹图谱进行相似度评价，并使用SPSS22.0软件进行聚类分析和主成分分析。选取了12个色谱峰作为指纹图谱共有峰，15批样品的相似度计算结果均大于0.990，说明各产地黄芪药材具有较好的一致性；通过聚类分析可将15批样品聚为4类；主成分分析采用3个主成分对黄芪药材进行综合评价，综合得分结果显示，甘肃民乐县所产批号为HQ-18001（S1）、HQ-18002（S2）和甘肃岷县所产批号为HQ-18007（S7）、HQ-18006（S6）的黄芪药材在所有样品中的综合得分位于前4名。建立基于传统煎药工艺的黄芪药材质量评价方法操作简单，重复性好，结果可靠，可以用于黄芪药材的质量控制和评价。

黄芪；HPLC；指纹图谱；质量评价；化学计量学

黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。作为常用传统中药之一，黄芪味甘、性平，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。现代化学研究发现，黄芪中含有皂苷、黄酮、多糖以及氨基酸、亚油酸、生物碱、胆碱等多种化学成分[2-4]，其中黄芪多糖、皂苷、黄酮[5]等化合物具有较强的生物活性。现代药理研究表明黄芪具有增强免疫力、抗疲劳、降糖、抗病毒、调脂、改善神经内分泌因子分泌、利尿、强心、降压等多种作用[6]，临床主要用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、血虚萎黄、内热消渴等病的治疗[7]。

目前国内外报道的关于黄芪药材指纹图谱研究的文献较多[8-13]，但是指纹图谱研究所用的样品处理方法是采用有机溶剂提取，对基于传统煎药工艺提取所制的黄芪样品指纹图谱的研究尚属空白。本实验将沿用传统煎药工艺，以水为溶剂提取黄芪样品，结合高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）建立黄芪药材的指纹图谱，并运用化学模式识别技术如聚类分析和主成分分析[9,14]，对黄芪指纹图谱进行模式识别，对不同来源的黄芪药材进行有效直观地鉴别和质量评价，深度挖掘黄芪水提取物指纹图谱所蕴含的药效成分信息，合理评价黄芪药材指纹图谱的整体特征，为采用传统煎药工艺制备的制剂，如经典名方制剂的质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器和Empower工作站（美国Waters公司）；ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器；XWK-III型空气发生器（天津市津分分析仪器制造有限公司）；MS-105D型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；X-30R型高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）。

1.2 材料

黄芪甲苷（批号110781-201717）和毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606）均购自中国食品药品检定研究院；黄芪皂苷I（批号H-038-181121）和黄芪皂苷II（批号H-037-171121）均购自成都瑞芬思生物有限公司；黄芪皂苷III（批号180419）购自南京森贝伽生物科技有限公司；毛蕊异黄酮（批号20120111）购自上海源叶生物科技有限公司；芒柄花苷（批号JBZ-0778）购自南京金益柏生物科技有限公司；刺芒柄花素（批号P1415345）购自上海泰坦科技股份有限公司。所有对照品质量分数均大于98%。冰乙酸（批号D1918059，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（HPLC级，德国Merck公司）；实验用水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

本研究收集了甘肃省民乐县、岷县及渭源县3个产地的黄芪药材，共15批，见表1。经笔者鉴定为蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪(Fisch.) Bge.的干燥根，具体见表1。

表1 黄芪药材信息

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、刺芒柄花素、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II、黄芪皂苷III对照品适量，精密称定，加甲醇溶解定容，制得质量浓度分别为1.024、1.960、1.019、1.034、1.241、1.068、0.999 0、1.058 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取黄芪药材粉末（过10号筛）约30 g，精密称定，加8倍量水浸泡30 min，加热回流60 min，趁热200目滤布滤过；药渣再加8倍量水，加热回流60 min，趁热滤过，合并2次滤液，待滤液冷却至室温后8000 r/min低温25 ℃离心10 min，全部上清液浓缩至30 mL，浓缩液加甲醇120 mL，混匀后静置30 min，离心（参数同上），上清液浓缩至10 mL，浓缩液加甲醇40 mL，混匀后静置30 min，离心（参数同上），上清液减压回收溶剂，残渣精密加入80%甲醇5 mL，超声使溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Hedera ODS-2柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司）；流动相：乙腈（A）-0.2%的冰乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～16 min，15%～23% A；16～20 min，23%～28% A；20～25 min，28%～30% A；25～30 min，30% A；30～35 min，30%～32% A；35～45 min，32% A；45～50 min，32%～40% A；50～55 min，40%～45% A；55～60 min，45%～65% A；60～65 min，65%～95% A）；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；载气体积流量2.7 L/min；漂移管温度102 ℃。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密吸取同一供试品（S1）各20 µL，按“2.1.3”项下色谱条件，连续进样6次测定，记录谱图。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，考察共有峰相似度的一致性。结果显示，各特征共有峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于5%，表明所用仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取同一批号（S1）的黄芪药材粉末6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，记录色谱峰。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于5%。

2.2.3 稳定性试验 将供试品溶液室温保存，分别于0、2、4、6、8、12、20、24 h测定HPLC色谱图，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于5%。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

2.3.1 黄芪药材HPLC指纹图谱的测定 分别取15批来源不同的黄芪药材30 g，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰（图1）。

将15批黄芪药材的HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A版进行色谱峰匹配，对获得的的指纹图谱进行处理后共标定并指认12个共有峰，经过与对照品溶液色谱图比对后，确认样品图谱中1号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，6号峰为黄芪黄芪皂苷Ⅱ，9号峰为黄芪皂苷Ⅲ，见图2。

图1 15批黄芪药材的HPLC指纹图谱

1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷 6-黄芪皂苷Ⅱ 9-黄芪皂苷Ⅲ

2.3.2 相似度评价 将15批黄芪药材样品指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A），利用中位数法，以S1号样品色谱图为参照谱图，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照谱图，以此作为黄芪药材的对照指纹图谱，进行相似度评价，S1～S15的相似度分别为0.996、0.995、0.999、0.998、0.999、0.996、0.999、0.999、0.991、0.999、0.993、0.998、0.998、0.997、0.998。15批黄芪药材的相似度计算结果均大于0.99，说明各产地的药材具有较好的一致性，可以用于综合评价黄芪药材的整体质量。

2.4 聚类分析

将不同产地的黄芪药材HPLC指纹图谱的12个共有峰的峰面积为特征，得到15×12阶原始数据矩阵，运用SPSS22.0分析软件对其进行聚类分析，采用组间连接法，以欧氏平方距离为测度，Z标准化，对样品进行聚类分析，结果见图3。15个黄芪药材样品总共可以聚为4类，批号为S1、S2、S3、S4聚为第1类；批号为S7、S10、S5、S13、S15、S11、S12、S8聚为第2类；批号为S6、S9为第3类，批号为S14单独成一类为第4类。从聚类分析的结果来看，黄芪药材的指纹图谱与其地理位置、外界环境具有一定的相关性，但不绝对相关。

图3 15批黄芪药材指纹图谱的聚类分析树状图

2.5 主成分分析

主成分分析是最常用的多指标线性降维压缩和多变量分析方法。它可将原有众多具有一定相关性的变量，重新组合成一组新的、相互无关的综合指标来代替原有的变量，从而实现以最少的主成分尽可能多的体现原变量的信息，以揭示数据结构特征，提取化学信息，已广泛应用于中药材的品质综合评价与分类。

采用SPSS22.0统计软件对15批的黄芪药材的指纹图谱数据进行主成分分析，将15批样品12个共有峰峰面积导入SPSS22.0软件，进行主成分分析。对于黄芪药材共有峰峰面积Z标准化处理后，计算相关系数矩阵，主成分特征值、累积贡献率及主成分综合得分等。

2.5.1 相关性分析 相关系数矩阵见表2。1号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，6号峰为黄芪皂苷II、9号峰为黄芪皂苷III。峰1（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）与色谱峰3具有较大的正相关性；峰2、4、5具有较大的正相关性；峰6和峰7具有较大的正相关性；峰9（黄芪皂苷III）、峰10、11和色谱峰12相互之间均有较大的正相关性。

2.5.2 特征值、方差贡献率 相关系数的特征值和方差贡献率见表3和图4。以特征值＞1为提取标准，得到前3个主成分的累积方差贡献率为90.268%＞85%，故选取前3个主成分即可进行评价，它代表了黄芪药材中12个成分量的90.268%的信息量，具有很好的代表性，足以评价黄芪药材的品质。

表2 相关系数矩阵

表3 特征值和方差贡献率

图4 公共因子碎石图

根据因子荷载矩阵，推测影响黄芪药材质量差异的并不是单一成分，而是多成分的协同作用的结果。从表4和图5中可以看出，第1主成分的信息主要来自于色谱峰5、6、7、9、10、11、12；第2主成分的信息主要来自色谱峰1、2、3、4；第3主成分主要来自色谱峰8的信息。

2.5.3 不同产地黄芪药材的综合评价 用3个主成分对黄芪药材进行综合评价，将得到的特征向量与标准化后的数据相乘，得到主成分表达式，再以每个主成分所对应的特征值占提取主成分的特征值之和的比例作为权重得到了主成分综合模型，根据主成分综合模型计算15批黄芪药材的主成分得分及综合得分值，见表5。综合得分越高，表明质量越好。综合得分显示，甘肃民乐县所产S1、S2和甘肃岷县所产S7、S6的黄芪药材在所有样品中的综合得分位于前4名，表明该4个批号的黄芪药材质量较好，对应药材指纹图谱信息，该4个批号的黄芪药材的指纹图谱中主要成分1、2、3、4、5、6、7、8的峰面积值均较大，结果也证明了主成分分析时提取的3个主成分能够基本体现指纹图谱的所有信息。综合聚类分析结果分析，第2类黄芪药材质量较差，其余批号的黄芪药材质量较好，且甘肃省民乐县所产S1的黄芪药材质量最好。主成分综合分析结果与聚类分析的结果相互得以印证。15个不同产地的黄芪药材的质量的差异，分析原因可能是不同的生态环境（包括土壤、气候、水分、矿物质分布情况等）对中药材的质量产生一定的影响。自然生态环境与中药资源的质量（有效成分的形成和积累）、数量密切相关，是其生态适宜性评价的客观基础，也是药材生产区划分的关键所在。不同批号的黄芪药材再按综合主成分得分值进行聚类分析，聚类结果见图6。15批黄芪药材分为3类，综合得分排名第1、2名的甘肃民乐县所产S1和S2的黄芪聚为第1类；S8、S9、S11的黄芪药材聚为第2类；其他批号的黄芪药材具为第3类，其中S7和S6批号的黄芪综合得分排名第3、4名，与上述聚类分析结果基本一致，略有不同。

表4 初始因子荷载矩阵

图5 样本在3个主成分的平面分布图

表5 主成分得分、综合得分排序

图6 15批黄芪药材指纹图谱主成分聚类图

3 讨论

本实验采用HPLC-ELSD法对黄芪药材指纹图谱的色谱条件进行深入摸索，获得的HPLC图谱重现性及精密度、稳定性均较好，有利于指纹图谱的进一步分析。

在流动相系统的选择中，分别以乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-0.2%冰乙酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行梯度洗脱实验。结果表明，乙腈-0.2%冰乙酸进行梯度洗脱为最佳，基线相对平稳，各主要峰之间能够基本实现基线分离，且峰形良好，在调整好流动相的不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，重复性和精密度较好，有助于指纹图谱的分析。

本实验分别考察了柱温在25、30、35 ℃时对色谱峰的分离影响。结果表明，随着柱温的升高，各色谱峰的保留时间稍有迁移；当柱温为25、30 ℃时，部分保留时间段内的色谱峰出峰比较接近，未能完全分离；当柱温为30 ℃时，各色谱峰的分离效果比柱温在25、30 ℃较好，且整体保留时间较为适中。综合考虑，故最终选择30 ℃作为黄芪药材HPLC指纹图谱的检测温度。

本实验对黄芪药材的指纹图谱进行了相似度评价、聚类分析及主成分分析。根据15个不同产地的黄芪药材指纹图谱的分析结果可以看出，15批药材的相似度计算结果均大于0.990，说明各产地的药材有较好的一致性。聚类分析将15批黄芪药材的指纹图谱聚为4类，聚类结果表明黄芪药材的指纹图谱与其地理位置、外界环境具有一定的相关性，但是不绝对相关。用提取的3个主成分对黄芪药材进行综合评价，综合得分结果显示，甘肃民乐县所产批号为S1、S2和甘肃岷县所产批号为S6、S7的黄芪药材在所有样品中的综合得分位于前4名；综合聚类分析，第2类黄芪药材的质量较差，其余批号的黄芪药材质量较好，且甘肃省民乐县产S1的黄芪药材质量最好。

本实验运用指纹图谱结合化学计量学对不同产地的黄芪药材质量进行评价，并采用传统煎药工艺进行黄芪药材样品的处理，较单一的含量测定更为全面准确，对综合评价和控制黄芪药材质量具有一定的参考意义，尤其是对以黄芪为原料采用传统水煎煮工艺制备的制剂质量评价具有很好的指导意义。

[1] 中国药典 [S]. 一部. 2015: 302.

[2] 杨玲. 黄芪的化学成分及其质量研究 [D]. 北京: 首都师范大学, 2008.

[3] 牟佳佳, 陈芳, 陈党辉, 等. 黄芪中5种黄酮类成分的含量测定及其指纹图谱研究 [J]. 药物评价研究, 2019, 42(5): 900-906.

[4] 史鑫波, 唐志书, 刘妍如, 等. HPLC-UV-ELSD法同时测定黄芪中黄芪皂苷和黄酮类成分 [J]. 天然产物研究与开发, 2019, 31(3): 434-440.

[5] 刘靖丽, 于海东, 梁艳妮. 中药黄芪中黄酮类化合物抗氧化活性的DFT研究 [J]. 化学与生物工程, 2019, 36(1): 36-40.

[6] 刘焰东, 蔡小丽, 张伟安. 中药黄芪的药理作用及临床应用效果研究 [J]. 心电图杂志: 电子版, 2019, 8(3): 37-39.

[7] 王青, 赵林华, 邸莎. 黄芪的临床应用及其用量探究 [J]. 吉林中医药, 2018, 38(12): 1450-1454.

[8] 汪海斌, 石岩, 李芳, 等. 中药黄芪指纹图谱的研究进展 [J]. 中国药房, 2017, 28(33): 4749-4752.

[9] 苏碧茹, 邓慧敏, 马宏亮, 等. HPLC-DAD-ELSD指纹图谱的化学模式识别用于黄芪质量评价 [J]. 中国中药杂志, 2013, 38(19): 3319-3323.

[10] 李婷婷, 舒志恒, 于良, 等. 不同产地黄芪HPLC/DAD指纹图谱及主要黄酮成分含量测定 [J]. 中国医院药学杂志, 2015, 35(13): 1182-1187.

[11] 芮雯, 冯毅凡, 石忠峰, 等. 不同产地黄芪药材的UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱研究 [J]. 药物分析杂志, 2012, 32(4): 607-611.

[12] 严治学, 何永志, 王颖. 黄芪HPLC-ELSD指纹图谱的建立及分析 [J]. 天津中医药大学学报, 2017, 36(2): 142-145.

[13] 王迪, 刘磊, 李科, 等. 基于内切-1,3-β-葡聚糖酶水解的黄芪糖指纹图谱的建立及不同种质资源黄芪鉴别[J]. 中草药, 2018, 49(10): 2320-2327.

[14] 聂韡, 朱培林, 房海灵, 等. HPLC指纹图谱结合化学计量学评价不同产地广东紫珠药材的质量 [J]. 中草药, 2017, 48(1): 185-191.

Fingerprints and quality evaluation ofby HPLC coupled with chemometrics based on traditional decoction process

ZHANG Qian1, YANG Huai-jin2, ZHOU Yue1, YU Yi-ting1, ZHUANG Xin-ya1, Mao Chun-qin1, XIE Hui1, LI Lin1, LU Tu-ling1, YAN Guo-jun1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nan jing MoChou Vocational School, Nanjing 210017, China

To establish a HPLC fingerprints evaluation method for the quality evaluation ofbased on traditional decoction process taking water as solvent.The fingerprints of 15 batches ofwere further evaluated by chemometrics methods. The similarity analyzed with “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica 2004A”, and hierarchical clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) were performed by SPSS 22.0.There were 12 common peaks, and the similarity degrees of 15 batches of samples were more than 0.990, which showed that all the samples from different origins were of good consistency. The samples were divided into four clusters by HCA. The result of PCA showed that the three factors were chosen, the quality of samples could be evaluated basically. According to the composite score, the quality of the batches of HQ-18001 (S1) and HQ-18002 (S2) ofproduced in Minle County of Gansu Province and the batches of HQ-18007 (S7) and HQ-18006 (S6) produced in Minle County of Gansu Province, were the top four in all the samples.The method is simple, reproducible, and reliable, which can be used for quality control and evaluation offrom different origins.

; HPLC; fingerprint; quality evaluation; chemical metrology

R286.2

A

0253 - 2670(2021)04 - 1128 -08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.026

2020-04-06

国家重点研发计划资助（2019YFC1710603）；国家自然科学基金项目（81773910，82074004）；江苏高校“青蓝工程”项目（2020）

张 倩（1995—），女，硕士研究生,研究方向为中药药剂学。Tel: 18260027862 E-mail: 1422943829@qq.com

严国俊，教授，主要从事中药新型剂型及质量评价方法研究。E-mail: yanguojun@njucm.edu.cn

[责任编辑 时圣明]