蟾皮化学成分和药理活性的研究进展

喻昌燕，孟令杰，姜 念，李三华，肖 毅，刘 云, 3*

蟾皮化学成分和药理活性的研究进展

喻昌燕1, 2，孟令杰1, 2，姜 念1, 2，李三华1, 2，肖 毅1, 2，刘 云1, 2, 3*

1. 遵义医科大学 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563000 2. 遵义医科大学生命科学研究院，贵州 遵义 563000 3. 遵义医科大学生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义 563000

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍gargarizans或黑眶蟾蜍的干燥全皮，已纳入壮药名录。作为一种民族药，常用于满族、回族和朝鲜族的民间药方，具有清热解毒和利水消肿之功效。目前已从蟾皮中发现100多个化合物，包括蟾蜍二烯羟酸内酯类、吲哚生物碱类、蟾蜍环酰胺类以及甾体类等成分。随着国内外药理学研究的不断深入，蟾皮单体成分呈现诸多药理作用，如抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗乙肝病毒、强心等，并且对特异的药物代谢酶具有较高的敏感性。通过查阅近20年来的国内外文献，对蟾皮的化学成分、药理活性、单体成分与药物代谢酶的相互作用等方面进行综述，以期为蟾皮更好的开发和应用提供参考。

中华大蟾蜍；黑眶蟾蜍；民族药；蟾皮；蟾蜍二烯羟酸内酯类；抗肿瘤；免疫调节；药物代谢酶

蟾皮，别名癞蟆皮、蟾蜍皮、干蟾皮、蛤蚆皮，状语称“能唝酬”，最早记载于《本经逢原》，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Schneider的干燥全皮，辛，凉，微毒，经方入药，目的多为以毒攻毒[1-2]。《中药大辞典》记载“蟾皮能清热解毒、利水消胀，治疗痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤、疳积腹胀和慢性气管”[3]。蟾皮作为一种民族药，已纳入壮药名录，是广西常用特色壮、瑶药材，民间广泛用于治疗恶性肿瘤[2]。满族常用蟾蜍细末外敷治疗疔毒疮和臁疮腿[4]；回族则用干蟾蜍对急性炎症进行止痛消肿[5]；而朝鲜族直接取蟾蜍皮烧熏治疗肠头挺出[6]。蟾皮及其制品临床应用较为广泛，特别是以干蟾皮为主要原料制成的水溶性制剂华蟾素为我国自行研发的二类新药，对原发性肝癌、肺癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤具有非常好的疗效[7]。目前已从蟾皮中分离获得100多个单体化合物，主要是蟾蜍二烯羟酸内酯类、吲哚生物碱类、蟾蜍环酰胺类、小分子环肽类以及甾体类等成分。随着蟾皮有效成分研究的不断深入，其中的单体成分在抗肿瘤、抗炎、免疫调节和强心等方面有显著药理活性。本文对蟾皮中化学成分和药理活性的研究进展进行梳理，为进一步开发和利用蟾皮提供理论依据和文献支持。

1 蟾皮的化学成分

蟾皮中化学成分复杂，通过分离与鉴定，已发现其中包含有蟾蜍二烯羟酸内酯类、吲哚生物碱类、蟾蜍环酰胺和小分子环肽类、甾体及其他类化合物[8-9]。

1.1 蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物

此类化合物属于强心甾体类化合物，以游离型或与硫酸盐、二羧酸酯和氨基酸在C-3位结合的形式存在，其结构特点是C-17位连有一个α-吡喃酮基团[10]。根据是否与有机酸相连可分为蟾蜍毒素类和蟾毒配基类，其中蟾蜍毒素类化合物只存在于新鲜的蟾皮中，经干燥加工，蟾蜍毒素类化合物的3位酯键完全水解，得到相应的蟾毒配基，部分水解则形成丁二酸（辛二酸等）蟾毒配基单酯[8]。目前，从蟾皮中已分离得到蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物90个，根据母核上取代基的不同，大致分为5类，母核结构见图1（I～V为母核，化合物80～90为无法归纳入母核的化合物），分离得到的化合物见表1。

图1 蟾皮中蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物的结构母核I～V及化合物80～90的化学结构

表1 蟾皮中的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物

续表1

编号化合物名称母核取代基文献 28远华蟾蜍精-3-单辛二酸酯（telocinobufagin- 3-hemisuberate）IR1＝OCO(CH2)6COOH, R3＝CH3, R4＝R6＝OH, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H9, 11, 19 29远华蟾蜍精-3-琥珀酰精氨酸酯（telocinobufagin- 3-succinoyl arginine ester）IR1＝OCO(CH2)2COArg, R3＝CH3, R4＝R6＝OH, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H19 30daigredorigeninIR1＝R4＝R6＝OH, R3＝CHO, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H16 3116-desacetyl-19-oxocinobufotalinIR1＝R4＝R6＝OH, R3＝CH3, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H16 32蟾蜍素（bufotoxin）IR1＝OCO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R6＝OH, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R7＝R9＝H12, 17, 20 33hellebritoxinIR1＝OCO(CH2)6COArg, R3＝CHO, R4＝β-OH, R6＝OH, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H16-17 34telocinobufatoxinIR1＝OCO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R4＝β-OH, R6＝OH, R2＝R5＝R7＝R8＝R9＝H16-17 35bufalitoxinIR1＝OCO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R6＝OH, R2＝R4＝R5＝R7＝R8＝R9＝H16-17 363-oxo-arenobufaginIR1＝R9＝O, R3＝CH3, R5＝α-OH, R6＝OH, R2＝R4＝R7＝R8＝H13 37蟾毒它灵-3-辛二酸酯（bufotalin 3-suberate）IR1＝β-O-suberate, R3＝CH3, R6＝OH, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R7＝R9＝H13 38(3β,5β,14β,16β)-3,5,14-trihydroxy-16-(acetyloxy)- 19-oxo-bufa-20,22-dienolideIR1＝β-OH, R3＝CHO, R4＝R6＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R7＝R9＝H13 39酯蟾毒配基（resibufogenin）IIR1＝R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝H, R3＝CH38-9, 16, 21 40resibufogenin-3-sulfateIIR1＝NaO3SO, R3＝CH3, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝H9 4111β-羟基-酯蟾毒配基（11β-hydroxylresibufogenin）IIR1＝R2＝R4＝R6＝R7＝R8＝H, R3＝CH3, R5＝β-OH8-9 4212β-羟基-酯蟾毒配基（12β-hydroxylresibufogenin）IIR1＝R2＝R4＝R5＝R6＝R8＝H, R3＝CH3, R7＝β-OH9 43酯蟾毒配基3-琥珀酰精氨酸酯（resibufogenin- 3-O-succinoyl-arginine-ester）IIR1＝CO(CH2)2COArg, R3＝CH3, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝H8-9, 14-15, 17 44华蟾毒精（cinobufagin）IIR1＝R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H, R3＝CH3, R8＝β-OAc8-9, 11-13, 21 45去乙酰华蟾毒精（desacetylcinobufagin）IIR1＝R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H, R3＝CH3, R8＝β-OH8-9, 11-12 46去乙酰华蟾毒精-3-琥珀酰精氨酸酯（desacetyl- cinobufagin 3-O-succinoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)2COArg, R3＝CH3, R8＝β-OH, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9, 14 47华蟾毒精-3-琥珀酰精氨酸酯（cinobufagin- 3-O-succinoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)2COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H8-9, 14-17 48cinobufagin-3-sulfateIIR1＝NaO3SO, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9 49cinobufagin-3-glutaroyl arginine esterIIR1＝CO(CH2)3COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9 50华蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯（cinobufagin- 3-pimeloyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)5COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9 51华蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯（cinobufagin- 3-suberoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9 52华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯（cinobufagin 3-adipoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)4COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H9, 12, 17 53华蟾毒精-3-单辛二酸酯（cinobufagin-3-hemisuberate）IIR1＝CO(CH2)6COOH, R3＝CH3, R8＝β-OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H19 5416-O-acetylarenobufagin 3-O-suberoyl arginine esterIIR1＝CO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R4＝R7＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝H14 55华蟾毒它灵（cinobufotalin）IIR1＝R2＝R5＝R6＝R7＝H, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝OAc8-9, 12-13 56华蟾毒它灵-3-琥珀酰精氨酸酯（cinobufotalin 3-O-succinoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)2COArg, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H14 57华蟾毒它灵-3-庚二酰精氨酸酯（cinobufotalin 3-O-pimeloyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)5COArg, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H14 58华蟾毒它灵-3-辛二酰精氨酸酯（cinobufotalin 3-O-suberoyl arginine ester）IIR1＝CO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H14

续表1

编号化合物名称母核取代基文献 59去乙酰华蟾毒它灵（desacetylcinobufotalin）IIR1＝R2＝R5＝R6＝R7＝H, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝β-OH8-9, 13 6019-oxo-cinobufotalinIIR1＝R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H, R3＝CHO, R8＝OAc9 6119-oxo-cinobufotalin 3-adipoyl arginine esterIIR1＝CO(CH2)4COArg, R3＝CHO, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H12 6219-oxo-cinobufotalin 3-O-pimeloyl arginine esterIIR1＝CO(CH2)5COArg, R3＝CHO, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H14 63cinobufotalin 3-nonanedioylarginine esterIIR1＝CO(CH2)7COArg, R3＝CH3, R4＝OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H16 64cinobufotalitoxinIIR1＝CO(CH2)5COArg, R3＝CH3, R4＝β-OH, R8＝OAc, R2＝R5＝R6＝R7＝H12, 17 65resibufotoxinIIR1＝CO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝H17 66cinobufotoxinIIR1＝CO(CH2)6COArg, R3＝CH3, R8＝OAc, R2＝R4＝R5＝R6＝R7＝H17 67海蟾蜍精（marinobufagin）IIR1＝R2＝R5＝R6＝R7＝R8＝H, R3＝CH3, R4＝OH9, 12, 22 68异沙蟾毒精（bufarenogin）IIIR1＝R3＝H, R2＝β-OH9 69ψ-bufarenoginIIIR1＝R3＝H, R2＝α-OH9 70bufarenogin 3-O-succinoyl arginine esterIIIR1＝CO(CH2)2COArg, R2＝β-OH, R3＝H14 71bufarenogin 3-O-suberoyl arginine esterIIIR1＝CO(CH2)6COArg, R2＝β-OH, R3＝H14 7211α-hydroxybufaginIVR1＝H, R2＝OH, R3＝OAc, R4＝CH313 73de-O-acetylcinobufotalinIVR1＝R3＝OH, R2＝H, R4＝CH311 74(3β,5β,15β,16β)-3,5,10-trihydroxy-14,15-epoxy-16- (acetyloxy)-19-norbufa-20,22-dienolideIVR1＝OH, R2＝H, R3＝OAc, R4＝OH13 75(3β,5β,14β,15β,16β)-3,5-dihydroxy-10-carboxy-14,15- epoxy-16-(acetyloxy)-19-norbufa-20,22-dienolideIVR1＝OH, R2＝H, R3＝OAc, R4＝COOH13 76argentinogeninVR1＝β-OH13 77(5β,14β)-11,14-dihydroxy-3-oxo-12-oxo-bufa-9(11),20, 22-trienolideVR1＝O13 78(3α,5β,14β)-3,11,14-trihydroxy-12-oxo-bufa-9(11),20,22-trienolideVR1＝α-OH13 79(3β,5β,14β)-3-[(7-carboxy-1-oxoheptyl)oxy]-11,14-dihydroxy-12-oxo-bufa-9(11),20,22-trienolideVR1＝β-O-suberate13 80沙蟾毒精（arenobufagin） 8-9, 14, 16, 18, 22 81desacetyl-bufogargarizin A 13 82desacetyl-bufogargarizin B 13 83(3β,5α,14β,19R)-3,19-epoxy-5,14-dihydroxy-19-methoxy-bufa-20,22-dienolide 13 84(3β,5β,14β,15β,16β)-3,5-dihydroxy-14,15-epoxy-16-(acetyloxy)-19-norbufa-20,22-dienolide 13 85(3β,5α,14β)-3,5,14-trihydroxyl-19-norbufa-20,22- dienolide 13 86(5β,14β)-14-hydroxy-3-oxo-bufa-1,20,22-trienolide 13 87(14β,15β,16β)-14,15-epoxy-16-hydroxy-3-oxo-bufa-4,20,22-trienolide 13 88(2β,5β,14β)-2,5,14-tridroxyl-bufa-20,22-dienolide 22 89(3α,16β)-3,16-dihydroxy-bufa-14,20,22-trienolide 22 90(3β,5β,16α)-3,5,16-trihydroxy-bufa-14,20,22-trienolide 22

1.2 吲哚生物碱类化合物

此类化合物含有吲哚环，是神经递质5-羟色胺及其代谢产物，目前已从蟾皮中分离获得11个吲哚生物碱类化合物，分别是5-羟色胺（serotonin，91）[23]、-methyl serotonin（92）[24]、-methyl serotonin（93）[24]、′-formyl serotonin（94）[24]、蟾毒色胺（bufotenine，95）[20]、5-methoxy bufotenine（96）[20]、脱氢蟾蜍色胺（dehydrobufotenine，97）[23]、蟾蜍色胺内盐（bufotenidine，98）[24]、去氢蟾蜍色胺氢溴酸盐（dehydrobufoteininehydrobromide，99）[25]、蟾蜍噻咛（bufothionine，100）[23-24]、脱氢蟾蜍噻咛（dehydrobufothionine，101）[26]，结构见图2。

图2 蟾皮中吲哚生物碱类化合物

1.3 蟾蜍环酰胺类和小分子环肽类化合物

有研究者从蟾皮中分离得到蟾蜍环酰胺类化合物，包括含有内酯结构化合物，如蟾蜍环酰胺B（bufogargarizanine B，102）[25]和蟾蜍环酰胺D（bufogargarizanine D，104）[26]以及不含内酯结构化合物，如蟾蜍环酰胺C（bufogargarizanine C，103）[25]（图3）；此外，还分离获得环（脯氨酸-甘氨酸）二肽[cyclo(Pro-Gly)dipeptide][23]和环（丙氨酸-丙氨酸）二肽[cyclo(Ala-Ala)dipeptide][26]等小分子环肽类化合物。

图3 蟾皮中蟾蜍环酰胺类化合物

1.4 甾体类

蟾皮中已分离得到的甾体类化合物有胆甾醇（cholesterol，105）[9,27]、β-谷甾醇（β-sitosterol，106）[27]、胆甾烯醇（cholestenol，107）[11]、胆甾烯酮（cholestenone，108）[26]、棕榈酸胆甾烯酯（palmitic acid cholesteryl ester，109）[9,27]、Cholestane-3β,5α,6β- triol（110）[9]、3α,12β,25,26-tetrahydroxy-7-oxo-5β- cholestane 26--sulfate（111）[14]，结构见图4。

1.5 其他类

蟾皮中还含有腺苷、嘌呤类、嘧啶类、氨基酸、有机酸、光色素等[9,23,24,26,28]。此外，徐乃玉等[29]在中华大蟾蜍皮粉中测得钙、镁、钠、锰、铁、锌、铜、磷、硅及银等元素，其中以钙最多，其次是铁和镁。

2 蟾皮的药理活性

《中药大辞典》记载“蟾皮能清热解毒、利水消胀，治痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤、疳积腹胀和慢性气管”[3]。现代医药学研究表明，蟾皮具有抗肿瘤、抗乙肝病毒等药理作用，临床上主要用于治疗乙型肝炎、慢性支气管炎、喉咙肿痛、痈肿疔毒等病症[27]；还可用于治疗顽固性皮肤病，如带状疱疹、荨麻疹、黄褐斑、银屑病等[30]。目前上市产品如华蟾素片（口服液、注射液）、华蟾素滴丸、鹤蟾片、季德胜蛇药片等均含有蟾皮成分[31]。

2.1 抗肿瘤作用

研究表明，蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物是蟾皮中具有抗肿瘤活性的主要成分[32]，能抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、抗血管生成、诱导肿瘤细胞分化、逆转肿瘤细胞多药耐药等[10]。

2.1.1 抑制肿瘤细胞增殖 细胞增殖在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用，因此控制细胞增殖对预防癌症至关重要[33]。华蟾毒精、海蟾蜍精、蟾毒灵和酯蟾毒配基对多种肿瘤细胞具有抗增殖活性，如多发性骨髓瘤、黑色素瘤、白血病、肝癌、卵巢癌、食管鳞癌、肺癌、结肠癌等[34-37]。这类化合物主要是通过调控细胞周期相关蛋白，引起细胞周期阻滞，进而抑制肿瘤细胞增殖，但不同的化合物在不同肿瘤细胞中引起的细胞周期阻滞时期不同，如蟾毒灵将食管鳞癌细胞周期阻滞于S和G2/M期[36]；酯蟾毒配基下调细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和cyclin E蛋白，降低RB蛋白磷酸化，引起结肠癌和肺癌细胞G0/G1期阻滞[37]。ψ-bufarenogin通过G2/M期阻滞抑制肝癌细胞增殖，下调cyclin E和ki67，上调cyclin B1[38]。沙蟾毒精对食管鳞状细胞癌细胞的抗癌效果优于蟾毒灵，且对人正常的食管鳞状Het-1A细胞表现出更低的毒性，还可通过激活p53信号通路有效抑制裸鼠移植瘤生长[39]。与酯蟾毒配基作用类似，蟾蜍噻咛亦能抑制人肝癌细胞增殖，促进小鼠肝肿瘤H22细胞坏死并抑制肿瘤生长，抑制率65.16%，通过调控线粒体介导的凋亡蛋白抑制肝脏肿瘤生长并保护肝脏免受急性损伤[40]。

图4 蟾皮中甾体类化合物

2.1.2 诱导肿瘤细胞凋亡 蟾皮中的有效化学成分作用于肿瘤细胞后，可转化成细胞凋亡信号，通过抑制或激活细胞内和细胞外的多种信号转导途径，诱导肿瘤细胞凋亡[33]。蟾毒灵促进活性氧积累，上调凋亡酶激活因子（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）、cleaved poly ADP-ribose polymerase（PARP）、剪切型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、cleaved caspase-9和Bax/Bcl-2，靶向线粒体依赖的信号通路诱导骨肉瘤MG-63细胞发生凋亡[41]。华蟾毒精激活ROS/MAPKs信号通路诱导卵巢癌细胞[42]和多发性骨髓瘤U266细胞[34]发生凋亡。沙蟾毒精显著上调半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、半胱氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸蛋白酶-9，通过内源性和外源性途径激活caspase，有效诱导食管鳞状细胞癌细胞发生凋亡[39]。ψ-bufarenogin抑制受体酪氨酸激酶介导的信号转导通路抑制肝癌生长[38]。海蟾蜍精（1.25 μmol/L）引起白血病HL-60细胞染色质凝结、核碎裂、核溶解、细胞收缩和膨胀、胞质空泡的发生以及膜解体；降低细胞膜的完整性，导致DNA断裂[35]。在胶质母细胞瘤U87和U373细胞中，蟾蜍噻咛通过上调半胱氨酸蛋白酶-12、C/EBP homologous protein（CHOP）、磷酸化蛋白激酶受体样内质网激酶（phospho-protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，p-PERK）、磷酸化真核翻译起始因子2α（phospho-eukaryotic translation initiation factor 2α，p-eIF2α）和转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）蛋白表达，触发内质网应激诱导细胞凋亡[43]。

2.1.3 抑制肿瘤细胞侵袭与转移 肿瘤细胞侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征，是一个复杂的、多因素调控的动态过程。研究发现，蟾皮中的有效成分可通过调控相关蛋白因子抑制肿瘤细胞侵袭转移。蟾毒灵抑制活化的B细胞的nuclear factor-κ-light- chain-enhancer和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/MMP-9通路抑制肝癌SK-Hep1细胞迁移和侵袭[44]。沙蟾毒精下调β-catenin通路抑制上皮-间质转化，进而抑制前列腺癌PC3细胞的侵袭转移[45]。Han等[46]研究表明，酯蟾毒配基显著降低结直肠癌HCT116细胞侵袭和迁移能力；上调上皮标志物紧密连接蛋白和E-钙粘蛋白的表达，并下调纤连蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达来破坏上皮-间质转化，以一种RIP3相关的方式抑制结直肠癌细胞侵袭和转移，显著减少小鼠脾移植MC38细胞产生的肝转移灶的数量和大小，最终抑制肝转移。

2.1.4 抗血管生成 血管生成被认为是癌症发展和生长的关键，发现和开发有效的血管生成抑制剂是癌症治疗的重要组成部分[33]。沙蟾毒精抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、侵袭、血管形成和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）磷酸化，通过抑制VEGFR-2信号通路抑制VEGF介导的血管生成[47]。华蟾毒精在体内下调血管生成抑制结肠癌的生长，以剂量相关方式显著降低人脐静脉内皮细胞分层的新血管系统和破坏血管网络的形成，减少低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的表达，诱导活性氧积累，下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）Ser2481位点和丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）Ser473位点磷酸化，表明华蟾毒精抑制肿瘤新生血管形成，破坏内皮mTOR/ HIF-1α信号通路触发活性氧介导的血管内皮细胞凋亡[48]。蟾毒灵与索拉菲尼联用显著抑制肝癌SMCC-7721细胞裸鼠移植瘤的血管生成，明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜和大鼠主动脉环的形成以及人脐静脉内皮细胞迁移和血管生成，下调与血管生成相关的多种细胞因子和VEGF，通过调节AKT/VEGF信号通路增强索拉菲尼的抗血管生成作用[49]。

2.1.5 诱导肿瘤细胞分化 大多数肿瘤细胞的分化和成熟程度都低于正常细胞，这使得它们能够快速增殖，因此，诱导肿瘤细胞分化可能是一种降低其增殖率，减少其恶性特征的良好治疗方法[32-33]。蟾毒灵是人骨髓白血病细胞分化的有效诱导因子，较低浓度（0.5～1.0 μmol/L）时，蟾毒灵能诱导白血病K562、U937、ML1和HL60细胞分化为单核细胞/巨噬细胞样细胞，与4'-demethylepipodophyllotoxin ethylidene-β--glucoside（VP16）、全反式视黄酸、1α,25-二羟维生素D3、重组肿瘤坏死因子-α联用能协同诱导白血病细胞分化[50]。蟾毒灵诱导人单核细胞的白血病THP-1细胞分化与细胞外调节激酶级联和蛋白激酶C同工酶相关[51]。

2.1.6 逆转肿瘤多药耐药 多药耐药是一种复杂的表型，多种结构上不相关的细胞毒性化合物具有耐药性，严重限制了许多常见恶性肿瘤的有效治疗，其机制与P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1、细胞凋亡、DNA异常修复和有机微环境等相关[33]。据报道，蟾皮中的活性成分具有逆转某些癌细胞多药耐药的能力。蟾毒灵能将ATP binding cassette subfamily B member 1（ABCB1）过表达的结肠癌HCT8/ADR、LoVo/ADR和HCT8/ABCB1细胞的化学敏感性逆转至其亲本细胞水平，以剂量相关方式增加细胞内阿霉素和罗丹明123的积累，显著抑制ABCB1蛋白表达水平，并刺激ABCB1的ATP酶活性，增加阿霉素对ABCB1耐药的结肠癌HCT8/ADR细胞裸鼠移植瘤的作用，表明蟾毒灵能够有效逆转ABCB1介导的多药耐药[52]。另有研究表明蟾毒灵在1 nmol/L时能增强肝癌BEL-7402/5-FU细胞的化学敏感性，逆转倍数为3.8倍，显著将细胞周期阻滞于G0/G1期，通过增加Bax/Bcl-xL比例诱导细胞凋亡，下调多耐药蛋白1以抑制药物外排泵活性，并减少胸苷酸合成酶的表达[53]。华蟾毒精也可显著提高P-糖蛋白底物药物对P-糖蛋白过表达结肠癌LoVo/ADR、HCT116/L和Cao-2/ADR细胞的敏感性，同时对其亲本细胞无影响，显著增强阿霉素对过表达P-糖蛋白细胞LoVo/ADR裸鼠移植瘤的作用，增加了化疗药物的细胞凋亡和多药耐药细胞内阿霉素和罗丹明123的积累，进一步机制研究发现是P-糖蛋白ATP酶的非竞争性抑制，并不改变P-糖蛋白的表达[54]。

2.2 抗炎与免疫调节作用

2.2.1 抗炎作用 在癌症相关炎症中，主要炎性基因产物的表达受核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）调控。蟾皮中活性成分蟾毒灵（0.3、0.6 mg/kg）能有效抑制卡拉胶诱导的大鼠足肿胀，下调一氧化氮合成酶、环氧合酶-2、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），显著抑制NF-κB信号通路[55]；在BALB/c小鼠哮喘模型中，蟾毒灵可减少肺组织炎性细胞浸润和杯状细胞增生，并抑制NF-κB和p-p65蛋白表达，提示蟾毒灵可能通过抑制NF-κB活力发挥其抗炎作用[56]。此外，吲哚烷胺类生物碱（-methyl serotonin、蟾毒色胺、脱氢蟾蜍色胺和蟾蜍噻咛）也能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB和TLR4/MyD88/MAPKs信号通路发挥抗内毒素炎症作用[57]；蟾皮水提取物、蟾皮60%乙醇提取物和蟾毒色胺均能有效抑制脂多糖和phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激的U937细胞促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌，这与抑制NF-κB的激活有关[58]。Zhang等[24]从蟾皮亲水成分中分离得到的总吲哚烷胺类生物碱在脂多糖刺激的斑马鱼胚胎中表现出显著的抗炎活性；质量浓度为50、100 μg/mL时，抗炎率分别为35%、55%，优于阳性药物消炎痛；其中-methyl serotonin能显著减少中性粒细胞的数量，呈剂量相关效应，质量浓度为100 μg/mL时，抗炎率为60%；而蟾蜍噻咛的抗炎活性相对较弱，质量浓度为100 μg/mL时，抗炎率仅30%。

2.2.2 免疫调节作用 哺乳动物免疫系统的主要功能是监测阻滞内稳态，防御病原体的入侵或感染，清除受损细胞等，包括癌症在内的许多疾病通常与免疫系统受抑制有关[33]，因此，急需增强免疫系统功能的药物。研究表明，蟾皮中的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物有增强免疫系统功能，蟾毒灵（5、10 mg/kg）显著减弱哮喘模型小鼠的高反应性，抑制气管肺泡灌洗液中总炎症细胞数，包括巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，通过降低血清中Th2相关细胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13和卵清蛋白特异的IgE）的释放来干扰Th2介导的免疫反应[56]。华蟾毒精促进小鼠淋巴细胞增殖，显著提高CD4＋/CD8＋T细胞比例，促进淋巴细胞从G0/G1期向S期转化，为S期向G2/M期转化提供必要条件；增强IL-2和IL-10的分泌，并提高巨噬细胞的吞噬能力[59]。Wu等[60]研究显示，华蟾毒精可通过增强Th1免疫反应，显著增强福尔马林灭活的沙门氏菌疫苗对小鼠的保护作用；显著促进小鼠脾细胞增殖，上调干扰素γ（infection requires interferon-gamma，IFN-γ）和一氧化氮表达，并增加沙门氏菌免疫小鼠血清中沙门氏菌特异的总免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）和IgG2a的表达水平；在体内，华蟾毒精能减少小鼠脾脏的菌落数，并延长沙门氏菌免疫小鼠感染活鼠伤寒沙门氏菌的存活时间。华蟾毒精还能有效抑制脂多糖诱导的树突状细胞成熟和多种细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12p40）产生，激活caspase-1并显著增强IL-1β的产生，上调树突状细胞中抗菌肽人β-防御素（human β-defensin，hBD-2）和hBD-3的基因表达，诱导中性粒细胞分泌人中性粒细胞多肽1-3（human neutrophil peptides 1-3，HNP1-3）和抗菌肽hCAP-18/LL-37，以增强中性粒细胞的抗菌活性[61]。远华蟾毒精能增强小鼠对卵清蛋白的Th1免疫反应，增强Th1转录因子T-bet mRNA表达水平，影响IFN-γ的分泌，促进卵清蛋白免疫的小鼠脾细胞增殖，CD3＋/CD4＋、CD3＋/CD8＋升高，证实远华蟾毒精对细胞免疫应答有增强作用[62]。

2.3 抗菌与抗病毒

蟾皮总生物碱为蟾皮的抑菌活性成分之一，蟾皮总生物碱的含量随乙醇浓度的升高而增多。王元清等[63]采用滤纸片法测定了蟾皮不同溶剂提取物的抑菌性能，结果发现，90%乙醇提取物的抑菌效果强于60%乙醇提取物，90%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的最小抑菌浓度分别为1000、500、500、500 mg/mL，且抑菌活性部位具有一定的耐热耐压稳定性。此外，远华蟾毒精和海蟾蜍精对大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为64.0、16.0 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为128 μg/mL[64]。

在乙型肝炎病毒感染期间，乙肝病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）促进免疫耐受和持续感染。Cui等[65]研究发现，超临界二氧化碳蟾皮萃取物浓度低于0.01 μg/mL时对HepG2.2.15细胞无显著细胞毒性作用，用0.1 ng/mL萃取物处理HepG2.2.15细胞6 d后，能有效抑制HBeAg和乙肝病毒核心抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）的分泌，抑制率分别为23.36%、30.94%，均高于阳性药物3CT（20.81%、17.38%）并且HBV mRNA表达水平也明显受抑制。蟾毒灵给药6 d后，在0.1 nmol/L时能显著抑制HBcrAg分泌（抑制率19.58%），效果优于阳性药物3TC，对HBeAg（11.36%）的抑制作用高于HBsAg，乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），乙肝病毒mRNA表达水平下降，但对乙肝病毒DNA无抑制作用；而华蟾毒精给药3 d后，在1 nmol/L时对HBeAg分泌的抑制效果（8.28%）与阳性药物3TC（100 μg/mL，7.71%）的作用相当，对HBeAg的抑制作用高于HBsAg，乙肝病毒mRNA表达水平下降，同样对HBV DNA无抑制作用[66]。

蟾毒色胺可通过烟碱乙酰胆碱受体的竞争性机制抑制狂犬病毒感染仓鼠肾成纤维BHK-21细胞，并呈剂量和时间相关效应，质量浓度为3.9 mg/mL时，感染抑制率达到100%[67]。与抗菌肽ocellatin-F1联用，具有协同抗狂犬病病毒的作用[68]。在小鼠体内，0.63 mg/d蟾毒色胺是抗狂犬病病毒感染的有效剂量，对动物的生理和中枢神经系统不会产生显著影响；高剂量（1.05和2.1 mg/d）的蟾毒色胺耐受性良好，只造成轻微的行为影响[69]。

2.4 强心作用

蟾皮中的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物属于强心甾类化合物，具有类似于洋地黄的强心作用[32]。陈才法等[70]研究表明蟾皮脂溶性成分对心肌细胞膜上Na＋-K＋ATP酶的抑制作用显著，抑制率为44%；蟾皮水溶性成分对心肌细胞膜上Ca2＋ATP酶活性的抑制率超过了50%，对Ca2＋-Mg2＋ATP酶活性抑制率大于60%。蟾毒灵在低浓度（0.01～0.5 μmol/L）范围内能有效增强离体豚鼠的心房收缩力，并对收缩频率及节律均无明显影响；在高浓度（≥0.7 μmol/L）时则引起心室正常收缩以外的收缩[71]。陈立等[72]将0.133 mg/mL华蟾毒精静脉恒速输入到心衰家兔体内后，家兔的左室内压（left intraventricular pressure，LVP）、左室内压最大变化速率（LVP±d/dmax）和平均动脉压（mean artery pressure，MAP）值均明显回升，且强心效力明显强于毒毛旋花子苷K，除此之外，华蟾毒精的最大有效剂量、最小中毒量、最小致死量和治疗指数也明显高于毒毛旋花子苷K。

蟾皮化学成分的药理活性见表2。

2.5 其他

蟾皮及其活性成分还具有抗癌痛[73]、升压和抗休克[32]等药理活性作用。朱树宽等[30,74]将蟾皮应用于临床治疗前列腺炎、精囊炎和精索静脉曲张等男科疾病以及顽固性皮肤病，如带状疱疹、荨麻疹、黄褐斑、银屑病等，均取得了良好疗效。

3 蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物与药物代谢酶的相互作用

代谢是机体处置外源性物质（药物或毒物）的最主要方式，由一系列酶促反应完成。在人体内分布有几百种结构和功能多样的药物代谢酶，它们不仅是机体防御和清除外源物的重要生化屏障，同时在维系机体内源性物质代谢平衡中也发挥着重要作用[75]。人体中重要的药物代谢酶包括细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）、葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase，UGT）、磺基转移酶（sulfotransferase，SULT）和羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）等。

CYP是I相代谢的主要酶系，主要存在于肝脏，作为终端氧化酶参与了临床约90%药物的代谢。Ge等[76]在对蟾蜍甾烯类系列化合物的结构-CYP酶催化选择性规律研究的基础上发现，CYP3A4在蟾毒灵-5β羟化中显示出极高的催化特异性，其催化效率比CYP3A5高出1000倍之多。CYP3A4在酯蟾毒配基-5β羟化中同样显示出比CYP3A5高的选择性，CYP3A4主要介导5β-羟化反应，是酯蟾毒配基在人肝脏中的主要代谢途径，主要代谢产物5β-羟基酯蟾毒配基能显著抑制肺癌A549和H1299细胞增殖并诱导细胞凋亡，对人类胚胎肺成纤维细胞毒性较弱，小鼠对其急性毒性有更强的耐受性[77]。蟾毒它灵在人肝微粒体中的主要代谢产物是5β-羟基蟾毒它灵，而CYP3A4和CYP3A5依旧是负责蟾毒它灵-5β羟化的关键酶[78]。此外，CYP3A还介导日蟾毒它灵和沙蟾毒精的代谢，具有高特异性[79]。代谢酶功能的评价及小分子-代谢酶相互作用研究均需要借助特异性探针底物。Tian等[80]通过一系列的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物硫化作用的表征发现沙蟾毒精是SULT2A1酶潜在的探针底物，具有较高的敏感性和特异性，体外反应实验证实沙蟾毒精的硫化作用对SULT2A1酶显示出较高选择性，该探针被成功的用于测定人和实验动物组织中SULT2A1酶及其同工酶的活性。杨凌等[81]以D环16位具有羟基的蟾蜍甾烯类化合物为特异性探针底物，发明了一类UGT1A3的特异性探针，借助UGT体外孵育体系开展特异性底物的UTG催化反应，以测定各生物样品及细胞中UGT1A3酶的活性，以期实现对重要药物代谢酶UGT1A3处置药物能力的评估。除此之外，该课题组还发明了一类蟾蜍甾烯类化合物（华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、酯蟾毒配基或蟾毒灵）可作为CYP3A4酶的高特异性探针底物，用于定量检测不同来源生物样本中CYP3A4酶活性，对体外药物代谢研究具有重要意义[82]。

4 蟾皮在方剂中的应用

蟾皮作为一种重要的中药材，可经方入药，已知用到蟾皮的方剂主要有蟾皮片、蛤蟆膏、五色兑金丸、理气降逆汤等。

4.1 蟾皮片[83]

处方：干蟾皮1两。

功能主治：血虚肝旺之外阴白斑症。

用法用量：上为细末或轧成片剂，每片1份。每服5片，日2次；或水泛为丸，每日1钱，分2次化服。

4.2 蛤蟆膏[84]

处方：干蟾皮，麻油熬，黄丹、铅粉收，槐枝搅。

表2 蟾皮化学成分的药理活性

功能主治：食积、痞块、疳疾、腿肿、湿气、疮毒。

用法用量：贴患处。

4.3 五色兑金丸[85]

处方：白丑60 g，干蟾皮9 g，飞滑石30 g，胡黄连15 g，六神曲15 g，陈胆星15 g，川黄连9 g，黑丑、飞青黛、大黄（上三味另研为衣）雄黄各60 g，生石膏30 g（上二味另研极细为衣）。

功能主治：小儿疳积虫痛。

用法用量：各研细末，沸水泛为小丸，每3克约300粒，以黑丑、青黛、大黄、雄黄、石膏5种药末分别为衣，分为无色。每服0.15 g，最多不超过0.9 g，量儿之大小，体之强弱，斟酌用之，不宜多服。

4.4 理气降逆汤[86]

处方：干蟾皮12 g，八月札30 g，急性子30 g，白花蛇舌草30 g，丹参15 g，瓦楞子30 g，夏枯草15 g，枸杞子30 g，紫草根30 g，苦参30 g，生马钱子4.5 g，生南星9 g，公丁香9 g，广木香9 g，蜣螂虫9 g，天龙丸15粒（每次5粒，分3次吞服）

功能主治：理气降逆，解毒辟秽。主气滞中阻，胃逆呕吐。（食管癌）

用法用量：水煎服，每日1剂，日服2次。

此外，在《中药辞海》[87]中也有记载：蟾皮0.4 g，儿茶0.4 g，元胡0.2 g，研细末压片。每次1.0 g，每日服1次。连服2周后，每次增加0.2～0.4 g，直至3周为1疗程。该药方对各型胃癌疗效有差异，其中对溃疡癌变的疗效最好，对胃癌合并幽门梗阻的疗效最差，胃癌患者服后能止血，止疼，促进食欲，并有缩小瘤块，消除腹水的效果。

5 安全性评价

蟾皮化学成分复杂，具有诸多药理活性作用，但同时会产生一定的毒性。金其泉等[88]对蟾皮制剂I号（水溶性成分）和II号（水脂混合成分）的安全试验研究发现I号急性毒性极低；给小鼠iv和ip II号，半数致死量分别为（3.81±0.22）、（26.27±0.31）mL/kg，I号、II号均可引起大鼠心电图异常，但未见死亡。随即该课题组又对华蟾素注射液开展亚急性毒性实验，发现4、20 mL/kg剂量均能抑制大鼠体质量增长[89]。另外，用华蟾素腹腔灌注治疗恶性腹水时，建议单次起始最大剂量≤100 mL，对于肝功异常患者，适当减少用量，并监测其肝功变化，若天冬氨酸氨基转移酶水平大于2.5～5.0 ULN时，需及时停药并作相关处理；而局部腹腔灌注治疗所引发的不良反应较小且可耐受[90]。此外，注射用蟾皮总碱急性毒性极低；长期毒性实验结果显示，大鼠和Beagle犬分别高剂量（170、52 μg/kg）连续腹腔给药3个月后肾脏尿素氮含量均高于正常值，且肾脏出现明显病理改变，恢复期1个月后肾脏各项指标恢复正常，表明注射用蟾皮总碱无明显及长期毒性，可供临床试用[91]。

6 结语

民族药蟾皮含有多种活性成分且药理作用广泛。虽然在化学成分、药理作用、药物代谢、毒理学等方面的研究已取得一定成果，但仍然存在一些不足：（1）对蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物的研究较多，主要集中在抗肿瘤、免疫调节、抗病毒和强心作用的机制方面，其中体外研究较多，缺乏较系统的动物体内研究以及重要的药理学参数（如阳性或阴性对照，最小有效剂量等）；（2）蟾皮单体化合物与体内药物代谢酶的相互作用研究不够深入全面；（3）在蟾皮的毒性研究中，主要针对蟾皮制剂（华蟾素）和注射用蟾皮总碱的毒性试验，而对其发挥药效的活性成分毒性研究较少。蟾皮制剂（华蟾素）临床应用疗效确切，但其作用机制尚不明确，随着分子生物学、药物化学和药物代谢等研究的不断深入，可以更加科学的阐明蟾皮活性成分与药理作用之间的关系，以便开发临床疗效更好、作用机制明确的蟾皮新剂型，促进蟾皮在临床上更广泛和安全的应用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Research progress on chemical constituents and pharmacological activities of

YU Chang-yan1, 2, MENG Ling-jie1, 2, JIANG Nian1, 2, LI San-hua1, 2, XIAO Yi1, 2, LIU Yun1, 2, 3

1. Guizhou Provincial College-based Key Laboratory for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 2. Institute of Life Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 3. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China

is the dry skin ofor, which has been included in the list of Zhuang medicine. As an ethnic medicine, it is often used in the folk prescriptions of Manchu, Hui and Korean nationalities, which has the effect of clearing heat and detoxification and reducing swelling. At present, more than 100 compounds have been found, including bufadienolides, indole alkaloids, bufogargarizanines, and steroids. With the development of pharmacology, the chemical constituents ofhave shown many pharmacological effects, such as anti-tumor, anti-inflammatory, immune regulation, anti-hepatitis B virus, heart strengthening, etc., which are also highly sensitive to specific drug metabolizing enzymes. In this paper, the chemical constituents, pharmacological activities, and interaction between monomer components and drug metabolizing enzymes ofin recent 20 years are reviewed in order to provide a reference for the further development and rational utilization of.

gargarizans Cantor;Schneider; ethnic medicine;; bufadienolides; antitumor; immune regulation; drug metabolizing enzyme

R282.71

A

0253 - 2670(2021)04 - 1206 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.035

2020-05-27

国家自然科学基金资助项目（81660611）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑[2020]4Y154）；遵义市科技计划项目（遵市科合社字[2018]18号，遵市科合HZ字[2020]83号）；遵义医科大学科研启动资金项目（F-843）

喻昌燕（1991—），女，硕士，实验师，研究方向为中药抗肿瘤药理。E-mail: 578087864@qq.com

刘 云（1980—），男，博士，教授，研究方向为小分子药物的研究与开发。E-mail: liuyunzy@126.com

[责任编辑 崔艳丽]