高糖对人牙髓细胞增殖及氧化应激的影响

凌晓旭，王家凤，沙 青，程博群，张志民

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种高发病率、严重危害人类健康的代谢性疾病[1]。糖尿病的慢性高血糖症会造成多种器官的损伤，发生多种并发症如心血管疾病、慢性肾病、糖尿病眼病和糖尿病足等[2]。糖尿病患者口腔问题的发生率也很高，如龋齿、口干、牙周病、唾液腺功能障碍和口腔感染[3]。牙髓是一种疏松结缔组织，在组织稳态、损伤和衰老过程中，牙髓的活力取决于牙髓细胞的活性。牙髓细胞活性的降低可导致炎症在内的多种病理状态产生[4]。糖尿病患者的牙髓可能病变近年来引起口腔学者的重视。糖尿病可能是牙髓感染的调节因素。由糖尿病引起的血管病变可能干扰组织营养和牙髓修复，并可能为厌氧微生物的发育创造微需氧状态[5]。糖尿病影响牙髓的愈合能力，病理性钙化增加[6]。

氧化应激为糖尿病并发症的一个重要致病因素，是高糖诱导细胞凋亡的主要因素。已有研究高糖对牙周膜干细胞、心肌细胞、足细胞、骨髓间充质细胞等氧化应激的影响。高糖是否诱导牙髓细胞的氧化应激，目前还缺乏相关资料。因此，为阐明高糖环境下牙髓活力改变的相关机制，本研究主要研究了不同浓度葡萄糖对人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPCs)增殖和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

HDMEM培养基、PBS、青/链霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美国)；胎牛血清(FBS)(BI，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)；线粒体膜电位试剂盒(JC-1)、CCK-8(碧云天公司，中国)；Anti-Cytokeratin8、Anti-Vimentin、HRP标记兔抗鼠二抗(万类生物公司，中国)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)试剂盒(南京建成公司，中国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；5%CO2恒温培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；流式细胞仪(BD AccuriTMC6，美国)。

1.2 人牙髓细胞的分离、培养及鉴定

收集吉林大学口腔医院口腔颌面外科门诊18～25岁健康、完整无龋的第三磨牙，均经患者(或家属)知情同意。将拔出的牙齿在无菌条件下取出牙髓消化离心后移至培养瓶，37 ℃、5%CO2细胞孵箱培养，3 d换液1次，爬出细胞密度达80%～90%时进行传代培养。取处于对数期生长稳定的牙髓细胞，制备细胞悬液，以5×103个/孔接种于24孔板中，行细胞波形蛋白及角蛋白免疫细胞化学染色，于倒置显微镜下观察。

1.3 实验分组

含葡萄糖浓度为25 mmol/L为正常组，葡萄糖5.5 mmol/L的培养液设为低糖组，50 mmol/L为高糖组，与50 mmol/L组渗透压相等并与5.5 mmol/L组葡萄糖浓度相等为高渗组，每组设4个复孔。实验重复3次。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将生长对数期的细胞接种于96孔培养板，不同葡萄糖浓度分别培养1、3、5 d，每天同一时间，每孔加入100 μL不含血清的DMEM 培养基，再加10 μL CCK-8，混匀后避光置于37 ℃CO2孵育箱培养1 h，以空白孔为调零孔，酶标仪测定在450 nm处吸光度值。

1.5 不同浓度葡萄糖对牙髓细胞氧化应激的影响

1.5.1 不同浓度葡萄糖对ROS的影响 ①荧光显微镜检测细胞内ROS含量：将细胞以1×105个/孔接种于6孔培养板，分组培养，达到干预时间72 h后，弃原培养基，加入含终浓度为10 μmol/L的荧光染料DCFH-DA的无血清培养基在37 ℃条件下避光孵育30 min，预温PBS洗3次，清洗结束后，孔板内可剩余少量PBS，荧光显微镜下观察并采集图片。 ②荧光酶标仪检测细胞内ROS含量：将细胞接种于96孔培养板，72 h后加入DCFH-DA荧光酶标仪分析，激发波长480 nm，发射波长530 nm。

1.5.2 不同浓度葡萄糖对MDA、SOD的影响 将细胞接种于6孔培养板，不同条件处理后72 h，PBS清洗两遍后弃尽液体，加入0.1%细胞裂解液400 μL，采用MDA、SOD试剂盒测定细胞中MDA、SOD的含量。

1.6 线粒体膜电位检测

采用JC-1荧光探针在细胞内的红/绿荧光强度比例来衡量线粒体去极化程度。细胞于培养瓶内不同条件培养72 h后，制备细胞悬液，加入JC-1在37 ℃孵育30 min，流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)的变化情况。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 牙髓细胞分离、培养及鉴定

利用组织块酶消化法获得的人牙髓组织顺利贴壁，培养3～5 d后，显微镜下观察可见组织块周围有细胞游出，细胞呈长梭形。约20 d左右细胞密度达80%时，用胰酶进行消化按1∶2传代培养，细胞呈放射状或旋涡状排列。体外培养的HDPCs抗波形蛋白染色阳性，胞质内可见棕黄色颗粒附着，抗角蛋白染色阴性，胞质内未见棕黄色颗粒，胞质呈粉色，胞核呈蓝色(图1)。

2.2 不同浓度葡萄糖对牙髓细胞增殖活性的影响

高糖对体外HDPCs增殖的影响结果如下：①不同浓度的葡萄糖刺激HDPCs 1 d及3 d，低糖组和高糖组的OD值呈时间依赖性增高，增殖的峰值均出现在25 mmol/L葡萄糖浓度的正常组(与低糖组及高糖组比较，P<0.05)。②不同葡萄糖刺激HDPCs 5 d，低糖组与高糖组均有所下降，峰值出现在正常组(与低糖组及高糖组比较，P<0.05)。③高渗透压刺激HDPCs,细胞增殖较正常组下降。

1a：原代人牙髓细胞培养第6天形态( ×40)；1b：人牙髓细胞第三代形态( ×40)；1c：波形蛋白免疫细胞化学染色阳性( ×100)；1d：角蛋白免疫细胞化学染色阴性( ×100)图1 人牙髓细胞的形态Fig.1 Morphology of HDPCs

图2 不同浓度的葡萄糖对HDPCs增殖的影响Fig.2 Proliferation effect of various concentrations of glucose on HDPCs

2.3 不同浓度葡萄糖对ROS的影响

荧光显微镜下观察，发现各实验组均出现绿色荧光，但强度不同，在正常组及低糖组的荧光强度较弱，而高糖组的荧光强度明显增强，如图3。采用多功能酶标仪对96孔板进行ROS定量测定，结果表明：各实验组荧光强度存在明显差异，高糖组OD值明显高于其他3组，且差异有统计学意义(P<0.05)，如图4。

2.4 不同浓度葡萄糖对MDA、SOD的影响

4组细胞中抗氧化应激物质的分析如下：MDA含量高糖组OD值(2.44±0.30)，明显高于正常组(1.39±0.12)，而SOD正常组(43.51±0.33)明显高于高糖组(23.52±0.38)，且差异有统计学意义(P<0.05)，说明高糖环境中SOD的活力降低，抗氧化能力下降。高渗组中MDA(1.49±0.35)、SOD(34.65±0.53)均与高糖组存在明显差异，说明高糖对于牙髓细胞的影响并非由渗透压引起，而是因改变了细胞内代谢物质引起。见图5。

3a：正常组；3b：低糖组；3c：高糖组；3d：高渗组图3 不同浓度葡萄糖HDPCs细胞ROS水平( ×100)Fig.3 The level of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose( ×100)

**：P<0.01，***：P<0.001图4 不同浓度葡萄糖牙髓细胞ROS的含量 Fig.4 The content of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose

*：P<0.05，***：P<0.001图5 不同浓度葡萄糖牙髓细胞 MDA、SOD水平Fig.5 The levels of MDA and SOD in HDPCs under different concentrations of glucose

2.5 不同浓度葡萄糖对线粒体膜电位的影响

JC-1试剂检测结果如图6所示，右上象限(Q2) 表示JC-1在细胞线粒体基质内，以聚合物的形式存在，产生红色荧光，说明细胞正常，MMP较高，右下象限(Q4) 表示 JC-1在细胞内以单体形式存在，不能聚集在线粒体中，发出绿色荧光，细胞处于凋亡早期，MMP较低。高糖组(16.5%) 与正常组(7.8%) 相比，绿色荧光明显增强，表示JC-1单体形态增多，提示高糖处理后的细胞线粒体膜电位降低。

6a：正常组；6b：低糖组；6c：高糖组；6d：高渗组图6 不同浓度葡萄糖对HDPCs细胞线粒体膜电位的影响Fig.6 Effects of different glucose concentrations on mitochondrial membrane potential in HDPCs

3 讨 论

口腔健康与糖尿病的关系已在文献中被广泛报道。在牙髓根尖周病方面，高糖水平增加大鼠牙髓组织骨桥蛋白的产生和病理钙化[6]。高血糖刺激骨吸收，抑制成骨细胞分化，骨修复能力降低[7]，根尖周病变的发生率提高。有研究发现暴露于DM患者口腔菌斑的牙髓干细胞的克隆数量明显减少[8]。一篇最近的综述纳入了10项研究以探讨DM对牙髓及根尖周病变演变的影响，分析表明DM作为牙髓病理进展的危险因素，影响疾病的易感性、流行、发展和组织愈合能力[9]。而对高糖环境中牙髓细胞变化的研究较少，因此研究高浓度葡萄糖对牙髓细胞的影响对探明糖尿病患者牙髓组织结构变化及其作用机制具有重要意义。

越来越多的证据表明，高浓度葡萄糖会对不同的器官、组织和细胞类型产生不同的影响。高糖环境可能通过下调cyclin D1和上调p21抑制牙周膜细胞的增殖和细胞周期进程[10]。另有研究表明，与其他类型的细胞相比，成纤维细胞更能抵抗高葡萄糖水平，只有当葡萄糖浓度达到33.3 mmol/L以上时，细胞凋亡才会显著增加[11]。本实验采用高浓度葡萄糖干预体外培养的牙髓细胞以模拟体内高糖环境，发现25 mmol/L葡萄糖作用于牙髓细胞1、3、5 d后，牙髓细胞形态良好，细胞增殖活性最强，提示25 mmol/L是细胞生长的最适浓度。因此，将该葡萄糖浓度作为正常培养葡萄糖浓度组。我们选择了体外浓度为50 mmol/L作为高糖组，这个剂量也得到了实验中毒性试验的支持，但是在该实验中25 mmol/L高糖也明显抑制HDPCs增殖[12]，我们的实验中发现25 mmol/L葡萄糖培养牙髓细胞1、3 d后，细胞增殖活性强，高浓度50 mmol/L葡萄糖作用后，细胞增殖活性显著降低(P<0.05)。随着培养时间的延长，5 d后各实验组牙髓细胞的增殖受到抑制，细胞整体活性均较低，原因可能是随着细胞增多，生长空间不足以及有害代谢产物的累积等。

牙髓作为牙本质-牙髓复合体的一部分，是一种高度血管化的组织，长期的血糖水平失衡导致牙本质AGE(糖基化终产物)的积累[13]。RAGE(AGE受体)分配在牙髓细胞表面，可能导致ROS水平剂量依赖性的增加[14]，高浓度的ROS激活免疫反应，细胞因子的产生增加，导致炎症细胞反应[15]。糖尿病时，牙髓内ROS代谢增强，氧化应激增强[16]。本研究结果与其一致。氧化应激为糖尿病并发症的一个重要致病因素。MDA是ROS与多不饱和脂肪酸反应的产物，检测细胞内脂质过氧化程度以反映氧化应激水平。而SOD是一种重要的、普遍存在的酶，具有中和超氧自由基的重要作用，是体现细胞内还原力水平的指标。本研究检测了不同浓度葡萄糖干预后牙髓细胞中ROS水平、MDA及SOD活力。结果显示，高糖组细胞内ROS和MDA含量均增加，而SOD活力降低，提示高浓度葡萄糖促进ROS生成，使MDA含量增高，降低牙髓细胞中抗氧化酶SOD的活力，从而诱导牙髓细胞发生氧化应激反应，进而导致牙髓细胞损伤，这可能是高糖微环境引发牙髓病变的机制之一。Leite[17]的研究结果显示糖尿病改变了牙髓的抗氧化系统，而动物实验中，糖尿病大鼠牙髓组织SOD活性降低[18]。

线粒体作为细胞的能量代谢中心，在维持细胞的功能和代谢方面发挥了重要作用，线粒体功能障碍则可能导致细胞损伤。氧化应激被认为是糖尿病及其相关并发症发病和进展的一个因素，线粒体和细胞核是氧化应激的两个主要靶点。线粒体是ROS的主要来源，特别是受损伤的线粒体可以释放出大量ROS，同时线粒体也容易受到ROS攻击而损伤，高水平的线粒体ROS损害线粒体膜，并与线粒体膜渗透性增加有关，后者导致ROS向细胞质中渗漏，并损害其他细胞器[19]。线粒体膜电位的变化能反映氧化应激的水平[20]。最近，Rizwan等[21]的实验研究了高糖环境对皮肤角化细胞影响，随葡萄糖水平升高，细胞中ROS不断积累，通过应激信号通路触发细胞线粒体功能障碍、炎症反应和细胞凋亡。而高糖环境诱导的HDPCs氧化应激、线粒体损伤及机制有待深入研究，本实验检测葡萄糖水平升高后牙髓细胞MMP降低，说明细胞处于凋亡早期，高糖可诱导牙髓细胞的凋亡，为后续实验奠定基础。

综上所述，高糖浓度抑制牙髓细胞的增殖，导致HDPCs线粒体膜电位下降，诱导氧化应激产生，高血糖环境降低了牙髓细胞的活力，也可能是糖尿病患者牙髓组织发生改变的一个潜在因素。本实验仍存在不足，未探讨高糖对牙髓病状态下牙髓细胞的影响，进一步解释糖尿病与牙髓病的关系。关于高糖诱导牙髓细胞凋亡的深层次机制、高糖诱导的氧化应激介导线粒体功能障碍和应激信号级联反应的改变、信号通路等，尚需要进一步研究。