马氏珠母贝NatF基因克隆及其表达分析

卢金昭 房晓宸 梁海鹰 何军军 申铖皓

摘要：【目的】掌握馬氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）Nα-乙酰转移酶60基因（PmNatF）在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式（PAMPs）刺激下的表达变化规律，为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据。【方法】运用RACE克隆PmNatF基因cDNA序列，通过ProtScale、ProtParam、PSITE-Search、SignalP 4.1、SMART及Cell-PLoc 2.0 Package等在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测PmNatF基因组织表达分布特征及其在不同发育时期和PAMPs刺激后的表达情况。【结果】PmNatF基因cDNA序列全长1142 bp，其开放阅读框（ORF）为693 bp，5'端非编码区（5'-UTR）为181 bp，3'端非编码区（3'-UTR）为268 bp，共编码230个氨基酸残基。PmNatF蛋白分子量约26.64 kD，理论等电点（pI）为8.54，总平均亲水性系数为-0.068，为不稳定的亲水蛋白;PmNatF蛋白不存在信号肽和跨膜结构域，包含有N-乙酰转移酶结构域（Acetyltransf_1 domain），其亚细胞定位于细胞质。PmNatF蛋白二级结构中，α-螺旋占36.52%，β-转角占6.96%，延伸链占22.91%，无规则卷曲占33.91%;其三维结构与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的NatF蛋白结构相似。PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源，其中与美洲牡蛎（C. virginica）和欧洲大扇贝（Pecten maximus）的NatF氨基酸序列相似性较高，分别为76.52%和75.22%。PmNatF基因在马氏珠母贝各组织中均有表达，以在性腺中的相对表达量最高;在不同发育时期也均有PmNatF基因表达，其相对表达量以卵的最高，担轮幼虫的最低。在脂多糖（LPS）刺激下，马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达呈上调趋势，于刺激24 h时达最高值;在肽聚糖（PGN）刺激下，至刺激6 h时出现明显的峰值;在聚肌胞苷酸（PolyI：C）刺激下，则在刺激72 h时出现峰值。【结论】PmNatF基因具有较高的保守性，在马氏珠母贝各组织及不同发育时期均有表达，尤其以性腺和卵的相对表达量最高，且经PAMPs刺激后在马氏珠母贝鳃组织中呈明显的差异表达，表明PmNatF基因可能参与马氏珠母贝生殖细胞的分裂和成熟及其免疫应答过程。

关键词：马氏珠母贝;NatF基因;性腺;卵;PAMPs刺激;表达特征

中图分类号： S968.316.1                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）11-3085-08

Cloning and expression analysis of NatF gene from

Pinctada fucata martensii

LU Jin-zhao1，2， FANG Xiao-chen1，2， LIANG Hai-ying1，2，3*， HE Jun-jun1，2，

SHEN Cheng-hao1，2

（1Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong  524088， China; 2Shenzhen Research Institute， Guangdong Ocean University， Shenzhen，Guangdong  518108， China; 3 Guangdong Provincial Engineering Research Center for Aquatic Animal Health Assessment， Shenzhen， Guangdong  518108， China）

Abstract：【Objective】By exploring the expression pattern of different tissues，different development stages，and pathogen-related molecular model（PAMPs） stimulation of Pinctada fucata martensii would provide a theoretical basis for the follow-up study of the N acetyltransferase 60（NatF） gene function and the molecular mechanism of response to stimulation. 【Method】The full length of NatF from P. fucata martensii （PmNatF） cDNA was obtained using rapid amplification of cDNA ends （RACE） technology. Bioinformatics analysis was carried out by online softwares such as ProtScale， ProtParam， PSITE-Search， SignalP 4.1， SMART， and Cell-PLoc 2.0 Package. And real-time fluorescence quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression of different tissues， different developmental stages，and performance after being stimulated by PAMPs of PmNatF. 【Result】 The results showed that the full length of PmNatF cDNA was 1142 bp， containing a 5' end non coding region（5'-UTR） of 181 bp， a 3' end noncoding region（3'-UTR） of 268 bp and an open reading frame （ORF） of 693 bp which encoded 230 amino acids. It was predicted that its molecular weight of PmNatF protein was about 26.64 kD and its theoretical isoelectric point（pI）was 8.54.The overall average hydrophilicity coefficient was -0.068， which was an unstable hydrophilic protein. Analysis of deduced amino acids showed that it had no signal peptide and transmembrane domain， and contained an acetyltransf_1 domain， and subcellular localization in the cytoplasm. In the secondary structure of PmNatF protein， α-helix accounted for 36.52%， β-turn accounted for 6.96%， extended chain accounted for 22.91%， and random coil accounted for 33.91%. Its three-dimensional structure was similar to that of Pacific oyster（Crassostrea gigas） NatF protein. The amino acid sequence of PmNatF was highly conservative among species， among which the amino acid sequence similarity with the NatF of American oyster（C. virginica） and European scallop （Pecten maximus） were high， 76.52% and 75.22%， respectively. RT-PCR showed that PmNatF was expressed in all the tested tissues， with the highest expression in gonads ， and the expression was also found in different developmental stages， with highest expression in the egg stage and lowest in trochophore stage. After stimulated by  lipopolysaccharide（LPS）， the relative expression reached the highest level at 24 h; under  peptidoglycan（PGN） stimulation， PmNatF was greatly up-regulated， peaked at 6 h; under PolyI：C stimulation， the relative expression reached the highest at 72 h. 【Conclusion】The PmNatF gene is highly conserved and  expresses in various tissues and in different developmental stages， especially the highly expresses in gonads and egg stage. It is differentially expressed in the gill tissue after stimulation with PAMPs， indicating that the gene may be involved in the process of in the division and maturation of germ cells and its immune response of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii; NatF gene; gonad; egg; PAMPs stimulation; expression characters

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31472306）;Guangdong Natural Science Foundation（2021A1515010962）;Special Project of Guangdong Seaport Construction and Fishery Industry Development （A2016 08B15）;Shenzhen Science and Technology Plan（JCYJ20180507183240459）

0 引言

【研究意义】海洋生物对环境刺激的应答初期均通过调控关键蛋白翻译后修饰，而进一步调控下游的级联反应（Li et al.，2020）。N-末端乙酰化（NTA）是真核生物中最丰富的蛋白修饰作用之一，在蛋白相互作用、蛋白复合物形成、蛋白降解、蛋白亚细胞定位/靶向及蛋白折叠等方面发挥重要作用（Behnia et al.，2004;Hole et al.，2011;Silva and Martinho，2015）。NTA是通过Nα-乙酰转移酶（NATs）将乙酰基从乙酰辅酶A（Ac-CoA）转移至底物蛋白N-末端α-氨基的一种蛋白修饰过程（Varland et al.，2018）。因此，克隆马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）Nα-乙酰转移酶60基因（PmNatF）cDNA序列并进行组织表达分析，可为后续研究NatF基因功能及其对刺激应答后的翻译后修饰提供理论依据。【前人研究进展】在真核生物中，主要存在6个NATs亚型（NatA～NatF），且分别具有各自的底物特异性，大多数NATs需结合1～2个辅助因子才能发挥作用;而NatD（Naa40）和NatF（Naa60）是单体酶，能独立发挥作用（Ree et al.，2015;Støve et al.，2016）。NatF与其他NATs一致，具有进化保守的结构特征，属于GNAT蛋白家族（Aksnes et al.，2015b）。NatF主要定位于高尔基体，参与跨膜蛋白的NTA，可催化N-末端具有Met-Lys-序列的底物而发生Nα-末端乙酰化，但在酵母中N-末端很少发生乙酰化（Linster et al.，2020）。NatF对维持人类高尔基体结构的完整性具有重要意义，敲除NatF基因会导致高尔基体破裂，进而抑制细胞增殖（Aksnes et al.，2015a）。高尔基体是细胞增殖中心的调节器，NatF通过乙酰化高尔基体功能相关底物蛋白，以维持高尔基体的结构（Linster et al.，2020）。已有研究发现，在果蝇（Drosophila melanogaster）Dme12细胞中，NatF不会对有丝分裂中期整齐排列于赤道板附近的染色体造成明显影响，但后期发现染色体分离缺陷（von Damme et al.，2011）。在植物中，NTAs通过调节免疫蛋白稳定性而调控植物免疫。其中，NatA在拟南芥（Arabidopsis thalia-na）中参与干旱胁迫响应并在植物免疫中发挥重要作用（Linster and Wirtz，2018）;NatB复合物参与盐胁迫应答，且NatB和NatC的缺失会导致发育缺陷及生长迟缓（Feng et al.，2020）;NatA和NatB以拮抗方式调控Nod样受体SCN1蛋白稳定性而调节植物免疫反应（Xu et al.，2015）;NatE通过乙酰化不同底物来调控不同发育过程（Feng et al.，2020）; NatF则通过翻译后修饰质膜蛋白以提高拟南芥的耐盐性（Linster et al.，2020）。【本研究切入点】马氏珠母贝是我国南方海水珍珠培育的主要贝类之一，分布广泛，且具有极高的经济价值（Lei et al.，2016;Wu et al.，2020）。马氏珠母贝的筏式养殖方式极易受到生物或非生物因素影响（Adzigbli et al.，2020），尤其在高密度养殖过程中各种病害频繁发生，其机体免疫应激研究已引起广泛关注，但至今鲜见针对马氏珠母贝NTA修饰的相关研究报道。【拟解决的关键问题】从马氏珠母贝鳃组织中克隆NatF基因并进行生物信息学分析，掌握其在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式（PAMPs）刺激下的表达变化规律，为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试2龄马氏珠母贝采自广东省湛江市徐闻珍珠养殖基地，清除贝体表面附着物，经实验室暂养1周后进行后续试验。TRIzol试剂和SYBR®Select MasterMix購自Thermo Fisher Scientific公司;Primer Star、反转录试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）、DNA Marker、rTaq DNA聚合酶及pMD19-T载体等购自TaKaRa公司;RACE试剂盒购自Clontech公司。

1. 2 总RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol法提取马氏珠母贝鳃组织总RNA，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND1000紫外分光光度计检测RNA质量。参照RACE试剂盒说明制备5'-RACE和3'-RACE模板，并参照RNase H说明合成cDNA模板。

1. 3 PmNatF基因cDNA序列获得

从已构建的马氏珠母贝血细胞转录组文库中搜索注释为NatF的Unigene序列，并进行BLASTx比对分析（He et al.，2019），设计PmNatF基因的特异性扩增引物（表1）。以鳃组织为RACE的模板，进行中间片段验证后采用巢式PCR扩增其5'端和3'端。将纯化的目的基因片段导入pMD19-T载体后，转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，过夜培养;挑取阳性单克隆菌落进行PCR检测，并送至广州生工生物科技有限公司测序。参考何军军等（2018）的方法，使用DNAMAN 8.0将Unigene序列和测序获得的序列进行重叠拼接，以获得PmNatF基因cDNA序列。

1. 4 PmNatF基因生物信息学分析

采用NCBI中的ORF Finder预测PmNatF基因开放阅读框（ORF）及其推导氨基酸序列;运用ExPASy中的ProtScale和ProtParam及PSITE-Search分别预测PmNatF蛋白的亲/疏水性、理化性质和功能位点;通过SignalP 4.1、SMART及Cell-PLoc 2.0 Package预测该蛋白的信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位;采用SOPMA和SWISS-MODEL预测PmNatF蛋白的二、三级结构;运用Jalview进行同源比对分析，并以MEGA X构建系统发育进化树。

1. 5 实时荧光定量PCR检测PmNatF基因表达情况

不同组织：挑选10只规格一致、活力较好的马氏珠母贝，取其血淋巴液（B）、闭壳肌（A）、肝胰腺（He）、鳃（Gi）、边缘膜区（Me）、中央膜区（Mc）、套膜区（Mp）和性腺（Go）等8个组织分别放入冻存管，并立即放入液氮中保存备用。不同发育时期：收集卵、受精卵、囊胚期、原肠胚、担轮幼虫、D型幼虫、早期壳顶幼虫期及眼点期等8个发育时期的马氏珠母贝全组织，分别放入冻存管，并立即放入液氮中保存备用。PAMPs刺激：取暂养1周的健康马氏珠母贝320只，随机分成4组，每组80只;采用闭壳肌注射的方法，试验组每只马氏珠母贝注射100 μL（10 μg/mL）脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）或肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）或聚肌胞苷酸（Polyinosinic acid-polycytidylic acid，PolyI：C），注射后3、6、12、24、48、72和96 h分别收集10只马氏珠母贝的鳃组织，对照组注射100 μL PBS。血淋巴液在4 ℃下3000 r/min离心5 min，弃上清液，经TRIzol试剂处理后同其他组织均置于-80 ℃冰箱保存备用。提取各组织样品RNA，以无RNA酶的DNase I进行处理，再用RNase H反转录合成cDNA模板，然后进行实时荧光定量PCR检测。以Actin为内参基因，采用2-△△Ct法换算各组织的PmNatF基因相对表达量。运用SPSS 26.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并以Duncan’s多重比较进行差异显著性检验（Wu et al.，2020）。

2 结果與分析

2. 1 PmNatF基因克隆及序列分析结果

经RACE克隆后，通过DNAMAN 8.0将Unigene序列和测序获得的序列进行重叠拼接，得到PmNatF基因cDNA序列全长为1142 bp。其中，5'端非编码区（5'-UTR）为181 bp;3'端非编码区（3'-UTR）为268 bp，包含26 bp的poly（A）尾巴;ORF为693 bp，共编码230个氨基酸残基（图1）。PmNatF蛋白分子量约26.64 kD，理论等电点（pI）为8.54。

2. 2 PmNatF蛋白理化性质预测分析结果

ProtScale预测结果表明，PmNatF蛋白总平均亲水性系数为-0.068，属于亲水蛋白，在第67位氨基酸处达最高疏水性，在第154位氨基酸处达最高亲水性（图2）。ProParam预测结果显示，PmNatF蛋白不稳定系数为39.78，属于不稳定蛋白。ScanProsite预测发现，在第21～155位氨基酸处包含有N-乙酰转移酶结构域（Acetyltransf_1 domain）（图3）。PmNatF蛋白不存在信号肽和跨膜结构域，其亚细胞定位于细胞质。SoftBerry-Psite预测其功能位点，证实PmNatF蛋白包含2个PKC磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个CAAX盒及5个微体C-末端定位信号序列。在PmNatF蛋白二级结构中，α-螺旋占36.52%，β-转角占6.96%，延伸链占22.91%，无规则卷曲占33.91%。SWISS-MODEL预测结果表明，PmNatF蛋白三维结构与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的NatF蛋白结构相似（图4）。

2. 3 NatF多序列比对及系统发育进化分析结果

BLASTx比对分析结果显示，PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源，其中与美洲牡蛎（C. virginica）和欧洲大扇贝（Pecten maximus）的NatF氨基酸序列相似性较高，分别为76.52%和75.22%，说明NatF高度保守。采用MEGAX对PmNatF氨基酸序列与美洲牡蛎（XP_022318747.1）、欧洲大扇贝（XP_033737223.1）、虾夷扇贝（Mizuhopectenyessoensis，XP_021379455.1）、太平洋牡蛎（XP_011444570.1）、小鼠（Mus musculus，NP_083366.1）、人类（Homo sapiens，NP_079121.1）和斑马鱼（Danio rerio，NP_001076341.1）的NatF氨基酸序列进行多序列比对分析，结果发现物种间的NatF氨基酸序列相似性较高（图5）。从基于NatF氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树（图6）也可看出，马氏珠母贝与美洲牡蛎、长牡蛎（C. gigas）、虾夷扇贝和欧洲大扇贝先聚为一簇，再与普通章鱼（Octopus vulgaris）聚为一大支，而人类、小鼠和斑马鱼聚为另一大支，与传统的物种分类相吻合。

2. 4 PmNatF基因组织表达分布特征及其在不同发育时期的表达情况

采用实时荧光定量PCR检测PmNatF基因在马氏珠母贝各组织中的表达情况，结果发现PmNatF基因在各组织中均有表达，以在性腺中的相对表达量最高，其次是血淋巴液和鳃组织（图7）。在不同发育时期也均有PmNatF基因表达，其相对表达量以卵的最高，其次是受精卵和囊胚期，担轮幼虫的相对表达量最低（图8）。

2. 5 PAMPs刺激后PmNatF基因在马氏珠母贝鳃组织中的时序表达特征

选择LPS、PGN和PolyI：C等病原激活马氏珠母贝先天免疫反应，实时荧光定量PCR检测PmNatF基因在马氏珠母贝鳃组织中的时序变化情况，结果表明，在LPS刺激下，马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达呈上调趋势，至刺激24 h时其相对表达量上升至最高值，然后缓慢恢复到正常水平（图9-A）;在PGN刺激下，马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达也明显上调，至刺激6 h时出现明显的峰值（图9-B）;在PolyI：C刺激下，马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达总体上呈先降低后逐渐上升的变化趋势，至刺激72 h时出现峰值（图9-C）。

3 讨论

NTA是真核生物中普遍存在的修饰形式（Linster and Wirtz，2018），与其他蛋白翻译后修饰相比，NTA生物学功能的研究相对较匮乏。质膜作为细胞与环境间的分子—信息交流接口，与质膜相关的NatF已引起广泛关注。本研究运用RACE成功克隆获得PmNatF基因cDNA序列，ScanProsite结构域预测结果表明PmNatF蛋白含有N-乙酰转移酶结构域（Acetyltransf_1 domain），屬于GNAT蛋白超家族。GNAT超家族由十几个蛋白家族组成，参与多种细胞过程包括应急调节、转录控制、细胞溶胶状态维持及保护细胞内容物免受细胞损伤等一系列功能（Xie et al.，2014;Salah Ud-Din et al.，2016;Czub et al.，2018）。PmNatF蛋白无信号肽和跨膜结构域，可能为胞内蛋白。Aksnes等（2015a，2015b）在人类NatF的第52～69位和第84～104位氨基酸区域发现较弱的跨膜结构域，表明NatF是一种面向细胞膜的外周膜蛋白，只有在脂质体存在的情况下C端才能折叠成α-螺旋构象，通过疏水和静电作用特异定位在高尔基体上。

PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源，其中与美洲牡蛎和欧洲大扇贝的NatF氨基酸序列相似性较高，分别为76.52%和75.22%，说明NatF高度保守。在真菌及酿酒酵母中，由于进化过程出现二次丢失而缺乏NatF，也可能是人类乙酰化程度高于酵母所致（Kalvik and Arnesen，2013），但目前尚无证据表明进化过程中高等真核生物的N-末端更易乙酰化（von Damme et al.，2011）。Rathore等（2016）研究表明，真核生物NATs的多样化并未增加，但不可否认NTA在多细胞组织中的重要作用。本研究采用实时荧光定量PCR检测PmNatF基因在马氏珠母贝各组织及不同发育时期的表达情况，结果发现PmNatF基因在闭壳肌、血淋巴液、鳃、性腺、肝胰腺、中央膜区、边缘膜区及套膜区等8个组织中均有不同程度的表达，且以在性腺中的相对表达量最高，其次是血淋巴液和鳃组织，在闭壳肌中的相对表达量最低;不同发育时期则以卵的PmNatF基因相对表达量最高，担轮幼虫的相对表达量最低。von Damme等（2011）研究发现，敲除果蝇Dmel2细胞的NatF基因会导致染色体分离缺陷，即NatF基因与生物体染色体分离密不可分（Hole et al.，2011）。PmNatF基因在马氏珠母贝卵中的高表达可能与其参与生殖细胞的减数分裂及成熟过程相关，且与染色体的分离密切相关（何毛贤等，2002）。

马氏珠母贝的养殖方式使其暴露在许多病原微生物及各种各样的环境条件下（He et al.，2020），鳃组织是马氏珠母贝与外界环境接触的主要器官，也是双壳类软体动物抵御细菌感染的第一道防线（Zhang et al.，2009;王志新等，2013）。PmNatF基因在马氏珠母贝鳃组织中高表达说明NatF在抵抗外界各种环境刺激时发挥重要作用，而PmNatF基因在马氏珠母贝鳃组织中的时序表达情况说明其对不同PAMPs刺激均产生免疫效应，但免疫效应时间不同。该结论为马氏珠母贝机体免疫及翻译后修饰研究打下了理论基础，也为开展贝类NatF的应激调控机理研究提供了基础资料。

4 结论

PmNatF基因具有较高的保守性，在马氏珠母贝各组织及不同发育时期均有表达，尤其以性腺和卵的相对表达量最高，且经PAMPs刺激后在马氏珠母贝鳃组织中呈明显的差异表达，表明PmNatF基因可能参与马氏珠母贝生殖细胞的分裂和成熟及其免疫应答过程。

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收稿日期：2020-10-26

基金項目：国家自然科学基金项目（31472306）;广东省自然科学基金项目（2021A1515010962）;广东省海港建设与渔业产业发展专项（A201608B15）;深圳市科技计划项目（JCYJ20180507183240459）

通讯作者：梁海鹰（1971-），https：//orcid.org/0000-0002-7998-9805，博士，教授，主要从事海洋生物功能基因及蛋白研究工作，E-mail：zjlianghy@126.com

第一作者：卢金昭（1997-），https：//orcid.org/0000-0002-9959-1642，研究方向为珍珠培育与加工，E-mail：571658258@qq.com