高效液相色谱法测定造影剂碘普罗胺中的相关杂质

(浙江司太立制药股份有限公司,台州 317300)

碘普罗胺(Iopromide)化学名为N,N′-双(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘-5-[(2-甲氧基)乙酰胺基]-N′-甲基-1,3-苯二甲酰胺,是一种非离子型碘造影剂的化学活性物质(API),是德国先灵(Schering)公司的原研药[1-2]。由于碘普罗胺的合成过程引入了杂原子氮,可能产生结构式如图1的杂质1～5,需对其含量进行严格控制[5]。欧洲药典[3]和美国药典[4]中的碘普罗胺专论对杂质1～5含量的测定方法为薄层色谱法(TLC),但文献中还未发现涉及碘普罗胺中杂质分析的报道。

为了克服TLC的专属性及灵敏度较低、操作繁琐、重现性较差等缺陷,本工作提出了高效液相色谱法(HPLC)测定碘普罗胺中的杂质1～5含量的方法,以期为碘普罗胺相关产品中杂质含量的控制提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo U3000型高效液相色谱仪,配多元泵、柱温箱、自动进样器和二极管阵列检测器。

杂质1 对照品:批号WS-1501-1,纯度不小于98%。

杂质2对照品:批号2188-015A9,纯度不小于98%。

杂质3 对照品:批号WS-1301-1,纯度不小于97%。

杂质4 对照品:批号WS-1301-1,纯度不小于97%。

杂质5 对照品:批号2120-070A2,纯度大于98%。

乙腈和2-丁醇为色谱纯,使用前经过0.2μm 滤膜过滤;试验用水为经Milli-Q 再次纯化的纯水;试验所用样品(批号C025-160800)由浙江司太立制药股份有限公司提供。

杂质4～5标准储备溶液:称取适量杂质4和杂质5对照品,加水溶解并稀释,制成1 g·L－1杂质4和杂质5单标准储备溶液。

混合对照品储备溶液:称取适量杂质1～3的对照品,取杂质4标准储备溶液10 mL和杂质5储备溶液5 mL 于同一小烧杯中,用水溶解后,转移至100 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,配制成杂质1、杂质2、杂质3、杂质4 合杂质5 质量浓度分别为0.25,0.50,0.25,0.10,0.05 g·L－1混合对照品储备溶液。

图1 杂质1～5的结构式Fig.1 Structural formulas of impurities of 1－5

混合对照品溶液:取混合对照品储备溶液2.0 mL于20 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,配制成杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5的质量浓度分别为0.025,0.050,0.025,0.010,0.005 g·L－1的混合对照品溶液。

系统适用性溶液:称取适量杂质1和杂质3,加水溶解并稀释,配制成2.5 mg·L－1的系统适用性溶液。

1.2 色谱条件

Eclipse C18Plus色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温35 ℃;流量1.0 mL·min－1;紫外检测波长245 nm;进样量10μL;流动相:A 为水,B为体积比为55∶40∶5的水-乙腈-2-丁醇混合溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.3 试验方法

称取碘普罗胺样品50 mg,加水溶解并定容至10.0 mL,按照仪器工作条件测定其中杂质1～5的含量。

1.4 外标法峰面积的计算方法

杂质1的峰面积为杂质1的两个主峰面积之和,即S1＝S1A＋S2B;杂质2的峰面积为杂质2第1个主峰面积除以46%,即S2＝S2A/46%;杂质3的峰面积为杂质3 的两个主峰面积之和,邓S3＝S3A＋S3B;杂质4的峰面积为杂质4第5个主峰面积除以25%,即S4＝S4E/25%;杂质5峰面积为杂质4第1个主峰与杂质5第2个主峰的重叠峰的峰面积与杂质4第5个主峰峰面积之差除以25%,即S5＝(S4A∩S5B－S4E)/25%。其中,S为峰面积,A～E为杂质主峰对应的顺序编号。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution

2 结果与讨论

2.1 方法的专属性考察

按照试验方法对系统适用性溶液、混合对照品溶液和加标样品溶液(加标量0.01 g·L－1)进行测定,结果见图2。

图2 系统适用性溶液、混合对照品溶液和加标样品溶液的色谱图Fig.2 Chromatograms of system suitability solution,mixed reference solution and spiked sample solution

由图2可知,杂质1和杂质3可有效分离,分离度为35,杂质峰和碘普罗胺峰能完全分离,每个杂质主峰间的面积比例相对稳定。杂质1,2,3,5和碘普罗胺均有2个主峰,杂质4有5个主峰,杂质1和杂质3的主峰不与其他杂质峰重叠,可以直接进行测定;杂质2的第2主峰与杂质5的第1主峰完全重叠,杂质4第1主峰与杂质5的第2主峰重叠,因此,杂质2,4,5应按照1.4节外标法峰面积的计算方法进行定量。

2.2 检测波长的选择

按照仪器工作条件对加标样品溶液进行紫外扫描,得到碘普罗胺、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4和杂质5的紫外吸收图谱见图3。

图3 碘普罗胺和杂质1～5的紫外图谱Fig.3 UV spectra of iopromide and impurities of 1－5

碘普罗胺及杂质1～5的最大吸收峰分别位于 241.0,242.8,245.6,243.9,243.2,242.0 nm 处,由于国家药品审评中心的碘美普尔标准(标准号JX20050001)建议此类杂质的检测波长为245 nm,故确定检测波长为245 nm。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

因为Eclipse C18Plus色谱柱对具有相似结构的化合物具有良好的分离效果,因此,试验采用Eclipse C18Plus色谱柱对系统适用性溶液和加标样品溶液进行测定。结果显示:杂质1和杂质3的分离度大于20,加标样品溶液试验中各杂质均有良好的分离。故试验选择Eclipse C18Plus色谱柱作为分离柱。

2.3.2 柱 温

试验考察了柱温分别为33,35,37 ℃时对系统适用性溶液及加标样品溶液中各杂质分离效果的影响。结果显示:当柱温为33℃和35℃时,各杂质的分离度均好于柱温为37℃时各杂质的分离度,由于35 ℃时的峰形较好,故将柱温确定为35 ℃。

2.3.3 流动相B中2-丁醇体积分数

根据国家药品审评中心的碘美普尔标准(标准号JX20050001),适量的2-丁醇有利于杂质的分离,故试验考察了流动相B 中2-丁醇的体积分数分别为3%～5%时对杂质1两个主峰分离效果的影响。结果显示:2-丁醇的体积分数为5%时,杂质1的两个主峰分离效果良好,体积分数为3%时,杂质1的两个主峰合并成了一个主峰,分离效果最差。故试验选择流动相B中2-丁醇的体积分数为5%。

2.3.4 流动相的流量

试验考察了流动相的流量分别为0.8,1.0,1.2 mL·min－1时对杂质分离效果的影响,结果显示:流量为1.0 mL·min－1时,杂质1～5分离效果较理想。故试验选择流动相的流量为1.0 mL·min－1。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

取适量混合对照品储备溶液,用水逐级稀释配制成质量浓度为碘普罗胺中杂质1～5限值[3](分别为25.7,50.5,25.6,10.1,5.1 mg·L－1)10%,50%,100%,150%,200%等5个系列的混合标准溶液,按照仪器工作条件测定,以各杂质的质量浓度为横坐标,其对应峰面积(按照1.4节方法计算)为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表2。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得检出限的计算结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.5 重复性和中间精密度试验

在50 mL容量瓶中加入50 mg样品和1 mL混合对照品储备溶液配制加标样品溶液,平行制备6份,按照仪器工作条件对其进行测定,得到杂质1～5测定值的相对标准偏差(RSD)分别为6.7%,6.4%,9.5%,2.6%,2.4%。

由第二人在不同高效液相色谱仪上按照同样的仪器工作条件对上述溶液进行测定,得到杂质1～5测定值的RSD 分别为7.2%,0.55%,1.1%,0.32%,0.20%。

由以上结果可知,杂质1～5 测定值的RSD(n＝6)均在国家药品审评中心建议的15%以内[8]。

2.6 稳定性试验

按照仪器工作条件对分别放置0,12,17,26,32 h后的加标样品溶液进行测定,得到杂质1～5在32 h内的测定值的RSD 分别为0.66%,0.67%,4.3%,0.87%%,0.22%说明样 品溶液 的稳定 性较好。

2.7 回收试验

对样品进行低、中、高等3个浓度水平(加标量分别相当于杂质1～5限值的50%,100%,150%)的加标回收试验,每个浓度水平平行配制3份,按照仪器工作条件测定。计算得到杂质1～5的回收率分别为105%,93.7%,95.2%,97.8%,112%。

2.8 样品分析

按照试验方法对样品进行分析,检出了杂质1和杂质2,质量分数分别为0.038%,0.19%。

本工作采用高效液相色谱法对碘普罗胺API中的杂质1～5的含量进行了测定,该方法前处理简单、回收率高、重现性好,可用于碘普罗胺杂质控制的研究及日常生产的质量控制。