酶解和酸解处理对杨梅汁键合态香气释放的影响

陈亦欣，陈虹吉，叶兴乾，2，刘东红，2，陈健初，2*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室 浙江省农产品加工技术研究重点实验室 浙江省食品加工技术与装备工程实验室 杭州310058 2 浙江大学馥莉食品研究院 杭州310058）

杨梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是杨梅科（Myricaceae）杨梅属（Myrica）常绿乔木植物，杨梅果实香气怡人，富含花色苷和类黄酮等活性成分[1]。由于杨梅成熟期集中、采后保鲜难，因此将杨梅加工成杨梅制品是一种可以有效缓解销售压力，减少杨梅采后损失，提高杨梅产品附加值的手段。杨梅汁是一种色泽艳丽、酸甜可口的饮料，其保质期长，且保留了花青素、抗坏血酸等生物活性化合物，具有一定的保健功能，有较大的市场发展潜力[2]。

香气是水果和果品加工产品品质评价重要的指标之一，其客观地反映了果汁的风味和商品品质[3]。香气物质以游离态和糖苷键合态的形式存在于水果中，游离态香气物质可被人直接感受到，对果香起主要贡献作用；糖苷键合态香气物质作为风味前体，与糖或无味的糖苷结合在一起，经水解释放后才能为人体感知[4-5]。在水果及其制品加工、贮藏过程中键合态香气成分会释放，引起香气的改变，对于键合态香气的研究能够为生产上提高产品品质提供理论支持[6-8]。目前，国内外研究学者已陆续从多种水果中发现了糖苷键合态香气物质，并对其结构、含量、水解方式、加工及贮藏过程中的变化等进行较为广泛而深入的研究[9]。例如：Pabst 等[10]分离得到树莓果实中的以键合态形式存在的4-氧代-β-紫罗兰醇和芳樟醇2 种物质。Wen 等[11]研究表明3 种樱桃中的键合态香气物质酶解后释放出苯甲醇、香叶醇和2-苯基乙醇等物质。一般情况下，酸解和酶解所得产物不完全相同。如：范刚等[12]在水解锦橙汁时发现，酸解产物以酚类和酮类为主，而酶解产物以酸类和醇类为主，且产物有较强的刺激性。酸解和酶解[13]的条件对产物的种类和含量也有影响。彭邦远等[14]比较了2 种来源的β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁的效果及差异性。Williams 等[15]在研究葡萄和葡萄酒时发现，酸解时pH 值条件不同，水解后产生的挥发性香气成分的种类有很大不同。目前对杨梅汁中的糖苷键合态香气物质的研究还未见报道。

本研究以杨梅为试验对象，采用Amberlite XAD-2 树脂吸附洗脱分离杨梅汁中的游离态和键合态香气物质，对得到的键合态香气物质在2种酸解条件（pH 1.0，2.0）和2 种酶解条件（β-葡萄糖苷酶、果胶酶）下进行水解释放，基于GC-MS分析方法对水解得到的键合态香气物质进行鉴定，并比较不同水解方式释放的挥发性物质组分的差异，为杨梅及其加工制品的增香调控提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荸荠种杨梅，采自浙江宁波慈溪。采摘后贮藏在-18℃冰箱中，待用。

Amberlite XAD-2（20～60 目），美国Supelco公司；β-D-葡萄糖苷酶（来源于杏仁，100 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g）、环己酮标品（≥99.9%），阿拉丁公司；所用试剂乙醚、戊烷、乙醇、NaCl 均为分析纯级，国药集团。

1.2 仪器与设备

SPME 自动进样装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国Supelco 公司；Agilent7890B/5977A 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 杨梅汁样品制备 将冷冻杨梅果实在常温下解冻、榨汁，经4 层纱布过滤得到粗汁。将粗汁用高速冷冻离心机离心（4 000 r/min，4 ℃）处理15 min，得到杨梅清汁，做固相微萃取供GC-MS 分析，每个试验重复平行3 次。

1.3.2 Amberlite XAD-2 树脂预处理 称取100 g Amberlite XAD-2 树脂于索氏抽提器中，先、后用戊烷、乙酸乙酯和乙醇回流处理后置乙醇中保存。装柱时使用乙醇为溶剂进行湿法装柱，用去离子水以4 mL/min 流速冲洗至无醇味后即可使用。

1.3.3 分离提取键合态香气物质 将1.3.1 节中得到的杨梅清汁以3 mL/min 流速流经处理好的Amberlite XAD-2 树脂柱，然后用去离子水洗柱至水澄清，目的是除去水溶性的糖和酸类物质。接着用乙醚/戊烷（1∶1）溶液洗柱除去游离态挥发性物质，再用乙醇将吸附在Amberlite XAD-2 树脂柱上的键合态挥发性物质洗脱出来。收集乙醇部分，在50 ℃下减压浓缩至干，用25 mL 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5.0）溶解，最后用100 mL 乙醚/戊烷（1∶1）溶液分3 次萃取除去残留的游离态挥发性物质，剩下的水相即键合态香气组分。

1.3.4 酶法水解键合态香气成分 参考林雯雯[16]的方法并稍作调整，分别称取β-葡萄糖苷酶与果胶酶4 mg，置于50 mL 顶空瓶中，加入上述水相，密封后38 ℃下保温水解48 h，将得到的酶解液进行固相微萃取，供GC-MS 分析，每个试验平行重复3 次。

1.3.5 酸法水解键合态香气成分 参考范刚[17]的方法并稍作调整，按照酸解pH 值的不同，将杨梅汁中键合态香气物质的酸解条件设置为剧烈和温和2 组条件，其中，剧烈酸解条件为：将1.3.3 节的水相部分，用1.0 mol/L HCl 调整为pH 1.0，置40℃摇床中水解4 d；温和条件为：将1.3.3 节的水相部分，用1.0 mol/L HCl 调整为pH 2.0，置40 ℃摇床中水解4 d。待水解完毕，将所有水解后的样品用1.0 mol/L NaOH 调pH 值至中性，将水解液进行固相微萃取，供GC-MS 分析，每个试验平行重复3 次。

1.3.6 固相微萃取（SPME）萃取挥发性成分 参考程焕[18]的方法稍作调整，准确量取4 mL 样品于20 mL 顶空进样瓶中，加入1.5 g NaCl 以促进挥发性成分的挥发，再加入10 μL 内标物环己酮（溶于乙醇，质量浓度为4.75 μg/mL），用聚四氟乙烯隔垫密封，放入自动进样装置。50 ℃加热平衡15 min 后，通过隔垫插入已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 的SPME 萃取头（270 ℃活化1 h），推出纤维头，顶空吸附30 min 后，插入GC-MS 进样口解析5 min。

1.3.7 GC-MS 分析 Agilent 7890B/5977A 气相色谱-质谱联用仪，气相色谱条件：毛细管柱为HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm），程序升温，起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升至240 ℃，保持4 min，进样口温度250 ℃。

质谱条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，离子化方式EI，电子能量70 eV，质量范围45～350 AMU。

1.3.8 香气物质的定性、定量分析 定性分析采用气相色谱-质谱联用仪，化合物经计算机检索与NISTII 谱库相匹配，选择较高匹配度的检索结果。利用C8～C20正构烷烃的保留时间计算每种香气物质的保留指数，再结合文献报道的已知化合物及保留指数进行比对，确认检测物成分。

定量分析采用内标法，内标物为环己酮（4.75 μg/mL 无水乙醇）。计算公式为：

1.4 数据统计分析

杨梅汁中键合态香气物质平行试验的平均值及标准差用软件SPSS 24.0（IBM）计算，使用Excel 2016（Microsoft）作图。

2 结果与分析

2.1 杨梅汁游离态香气物质

表1 列出杨梅汁中主要的游离态和键合态香气物质，共鉴定出34 种游离态香气物质，包括萜类物质18 种，酯类8 种，醇类4 种，烷烃类3 种及醛类1 种。游离态物质总含量为32 751.79 μg/L，其中萜类物质含量最高，占总含量的84.40%，β-石竹烯（木香，辛香）是检出的含量最高的游离态香气物质，其次为异石竹烯（木香，辛香）、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯（坚果香）、β-石竹烯氧化物（草药香，木香）、γ-壬内酯（花香，椰子香）等。Kang等[19]对杨梅进行HS-SPME 和GC-O 分析，结果表明萜类物质是主要的挥发性成分，占总含量的89.9%，同时也检测到芳樟醇、苯乙醇、γ-壬内酯等具有高香气强度的物质，与本研究结果基本一致。

2.2 不同酶水解得到的杨梅汁键合态香气物质

β-葡萄糖苷酶[7]和果胶酶[20]是常用于水解键合态香气物质的2 种酶，用2 种酶分别对杨梅汁释放的键合态风味物质进行酶解，得到的键合态挥发性组分具有明显差异。由表1 可知，2 种酶水解共释放出22 种键合态香气物质，β-葡萄糖苷酶水解得到的物质总含量为845.42 μg/L，果胶酶水解所得物质总含量为545.83 μg/L，香气损失率高于β-葡萄糖苷酶。2 种酶共同释放出14 种物质，包括3 种醛酮类、2 种醇类、5 种酯类、2 种萜类等。顺-3-壬烯-1-醇（花香、青草香）是β-葡萄糖苷酶水解后检出的含量最高的物质，为230.33 μg/L，而果胶酶水解后得到的含量仅为84.35 μg/L。十六酸甲酯（蜡味）是果胶酶水解后检出的含量最高的物质，为116.90 μg/L，β-葡萄糖苷酶水解后仅有55.12 μg/L。苯乙醇（果香，蜂蜜香）也被检出以键合态的形式存在，β-葡萄糖苷酶水解后检出160.15 μg/L，接近果胶酶水解后（55.55 μg/L）的3倍，苯乙醇在草莓和树莓中也被检出以键合态的形式存在[10，21]。萜类物质是水果中重要的键合态香气物质[22]，酶解后β-石竹烯和香树烯氧化物都被检测到，其中β-石竹烯（辛香、木香）是荸荠杨梅中含量最高的萜烯类物质[23]。此外，在2 种酶的处理下都检出2-戊基呋喃（花香、果香）和4-乙基愈创木酚（丁香味）。

图1 显示了不同酶解得到的杨梅汁键合态香气物质的种类、组成情况，其中β-葡萄糖苷酶释放所得物质以醇类为主，占总含量的70.51%，其次是酯类（15.99%）、萜烯类（3.86%）。Lasekan[7]将黑梅（Vitex doniana sweet）中的键合态物质经β-葡萄糖苷酶酶解得到的主要物质是醇类，这与本研究结果一致。果胶酶水解得到的键合态风味物质以酯类为主，占总含量的49.30%，其次是醇类（25.62%）、醛酮类（6.96%）、萜类（6.41%）。β-葡萄糖苷酶水解释放出175.90 μg/L 3，6-壬二烯-1-醇（黄瓜香）、8.61 μg/L 3-苯丙醇（果香）和21.08 μg/L 4-异丙基苯甲醇（木香，草药香）等4 种果胶酶未释放出的键合态风味物质，且多为嗅感物质。经β-葡萄糖苷酶水解后产生的这些香气可能是构成杨梅复杂浓郁香气的一部分，而经果胶酶水解杨梅汁后的物质并不具有此类香气。果胶酶水解后也产生4 种新物质，分别为1，2，3，4-四甲基苯8.41 μg/L，间叔丁基苯酚1.33 μg/L，月桂醛10.96 μg/L 和肉豆蔻酸甲酯5.37 μg/L。其中，月桂醛具有柑橘香，含量较低，而其它物质并不具有相应的香气成分。综合比较，使用β-葡萄糖苷酶所处理的杨梅汁香味较强于果胶酶所处理的杨梅汁，因此β-葡萄糖苷酶更适合作为杨梅汁的风味增香酶。

图1 不同酶解得到的杨梅汁键合态香气物质的种类、组成Fig.1 The composition and contents of bound volatile compounds in Myrica rubra juice hydrolyzed by different enzymes

表1 杨梅汁中主要的游离态和键合态香气物质Table 1 Main free and bound volatile compounds in Myrica rubra juice

（续表1）

（续表1）

2.3 不同酸解条件下水解得到的杨梅汁键合态香气物质

杨梅汁中的键合态香气物质在其加工和贮藏过程中会发生自发的水解释放。2 种酸解条件（pH 1.0，pH 2.0）的结果见表1，共释放19 种键合态香气物质，pH 1.0 条件下酸解得到的键合态风味物质总含量为1 215.2 μg/L，pH 2.0 酸解所得含量为734.15 μg/L，香气物质含量明显低于pH 1.0条件下的酸解结果。相同的结论也出现在其它研究中，如任婧楠等[9]发现pH 值越低越有利于糖苷键的水解，得到的键合态香气物质种类越多，而在过低的pH 值条件下容易引起键合态香气物质发生化学反应。2 种酸解条件共同释放出13 种物质，包括1 种酮类，1 种醇类，4 种酯类，3 种萜类和4 种烷烃类。2，4-二甲基苯乙烯（柑橘香，松树香）是酸解后含量最高的物质，分别为229.28 μg/L（pH 1.0）和214.53 μg/L（pH 2.0），无明显差异。2-戊基呋喃（花香，果香）也被检出以键合态的形式存在，含量分别为150.25 μg/L（pH 1.0）和154.41 μg/L（pH 2.0），差异较小。对伞花烃具有柑橘味，pH 1.0 条件下得到的含量为130.76 μg/L，接近pH 2.0 结果（23.52 μg/L）的6 倍。2 种pH 值条件下共同检出的3 种萜类物质，分别为γ-松油烯（苦味）、1-松油醇（霉味）和水芹醛，并不是杨梅的特征香气物质。

图2 显示了不同pH 值条件下酸解得到的杨梅汁中键合态香气物质的种类、组成情况。2 种条件下酸解所得键合态物质均以烷烃类为主，约占55%。pH 1.0 条件下酸解释放出顺-2-壬烯醛187.46 μg/L、茶螺烷45.60 μg/L、α-二去氢菖蒲烯26.31 μg/L 和卡达烯9.19 μg/L 4 种在pH 2.0 条件下未释放出的键合态风味物质。其中，顺-2-壬烯醛具有黄瓜香，茶螺烷具有蜂蜜香，α-二去氢菖蒲烯具有木香。pH 2.0 条件下酸解也产生2 种新物质，分别为4-松油醇和β-大马酮，质量浓度分别为18.81 μg/L 和55.08 μg/L。β-大马酮具有花香、果香，而含量较低，4-松油醇具有土味、霉味的不良味道。综合比较，pH 1.0 条件下酸解处理得到的键合态香气物质种类多，香气成分更为丰富，而pH 2.0 条件下有异味产生，因此在pH 1.0 条件下水解产生的键合态香气物质更为全面。

图2 不同pH 值条件下酸解得到的杨梅汁中键合态香气物质的种类组成Fig.2 The composition and contents of bound volatile compounds in Myrica rubra juice hydrolyzed by acid at different pH conditions

2.4 酶解与酸解比较

2 种水解方式得到的杨梅汁键合态香气组分数量上相差不大，而种类构成有很大差别。酶法水解得到的组分以醇类和酯类物质居多，其中含量最高的是顺-3-壬烯-1-醇，还检出苯乙醇、β-石竹烯等物质。酸法水解得到的组分则以烷烃类偏多，含量最高的是2，4-二甲基苯乙烯，其次是顺-2-壬烯醛、2-戊基呋喃和对伞花烃等，酸解后的产物有较强的刺激性及异味的成分。Sakho 等[24]在研究芒果时，既用了三氟乙酸水解，也用了果胶酶水解，结果在酶解后并没有发现酸水解产生的芳樟醇和香叶醇，分析它们可能是游离态或键合态多元醇重排后的产物。

酸解产生的物质中只有十六酸乙酯、2-戊基呋喃和对伞花烃在游离态物质中有检出，酸解后产生的萜类物质在游离态物质和酶解产物中都未发现。而酶解结果中苯乙醇、顺-3-壬烯-1-醇、十六酸乙酯、β-石竹烯和2-戊基呋喃等5 种物质在游离态香气物质中也有检出，据文献报道这些都是杨梅的特征香气物质[19]。Dziadas 等[25]对4 种合成的萜烯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（香叶基、橙花基、香茅基、桃金娘烯基）进行酸解和酶解，结果表明，酶水解后85%～91%的总峰面积是萜烯糖苷配基，而酸水解释放的萜烯糖苷配基面积不超过总峰面积的1.3%，表明酸水解几乎完全分解或转化了萜烯糖苷配基。Hampel 等[26]对含有游离态物质（芳樟醇、癸酸乙酯、紫罗兰酮）和糖苷键合态物质（正辛基-、正十二烷基-、苯基-D-吡喃葡萄糖苷）的混合物进行了酸解和酶解，结果表明，酸水解释放20%～60%的键合态物质，50%的游离态物质发生了降解；而酶水解释放90%～100%的键合态物质，且对游离态物质影响不大。

酸解和酶解都可以通过将糖苷键断裂，从而释放出键合态香气成分，然而其得到的香气组分不同，可能与水解机制和反应强度有关。酸解作用比较剧烈，且没有选择性，从而会影响香气组分的稳定性，易产生异味成分，而且不可避免地发生重排反应，往往不能反映真实的糖苷结构；而酶解具有选择性和高度的专一性，条件比较温和，释放出的香气成分更接近杨梅本身的风味，因此更适宜用作分析糖苷类香气前体结构[12]。

3 结论

本研究基于不同水解方式对杨梅汁键合态香气物质释放的效果进行分析。结果表明：β-葡萄糖苷酶水解后得到的香气物质含量高，更适合作为杨梅汁的风味增香酶。pH 1.0 条件下酸解处理检出的键合态香气物质种类多，成分更为丰富。酶解和酸解条件得到的键合态香气物质存在显著性差异，酸解后的产物没有杨梅的特征香气，且包含异味成分，而酶解得到的组分更接近杨梅本身的风味，因此利用β-葡萄糖苷酶酶解是更适合杨梅汁中键合态香气物质释放的方法。