CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用

刘欣欣，李 赫，卜庆云，田晓杰，王臻昱，何明良，唐佳琦，李秀峰，孟 威

(1.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150060；2.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；3.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

0 引 言

水稻是我国的主要粮食作物之一，近年来受耕地面积的减少以及各种生物胁迫的影响，水稻的产量已下降[1]。为了提高水稻产量和水稻的品质，经过国内外专家的不懈努力，水稻育种已经由传统育种进入到借助分子生物学、分子遗传学以及经典遗传学等理论，运用分子标记技术辅助育种[2]、生物信息学[3]、转基因育种技术[4]、分子设计学育种[5]等方法进行的分子育种的阶段。由于现代水稻分子育种具有更广泛的实用性，以及育种周期短、效率高等优点，已经成为水稻育种的主要发展方向。

任何新的育种技术的研发和应用都会带来新的改变，基因编辑技术就是典型的代表[6]。基因组编辑技术[7]是利用工程核酸酶诱导基因组产生DNA双链断裂，进而激活细胞内源修复机制，实现对基因组的精确的修饰(替换、插入或缺失)。

高效的基因编辑技术是研究细胞过程和生物分子机制的重要工具，基因编辑技术在育种上的应用十分广泛[8]。在现代基因编辑技术的发展过程中，分别出现了锌指核酸酶系统(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶系统(TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复序列系统(CRISPR)[9]。三种基因编辑系统具有不同的编辑原理，且不同编辑系统作用的方式也不相同，但都依赖于经过人工改造的限制性内切酶[10]。ZFN和二代基因编辑技术TALENs作为最初的基因编辑技术，二者都是由DNA结合蛋白和核酸内切酶FokⅠ融合而成[11-12]，能够精确识别并特异性切割DNA序列，使DNA双链发生断裂，最后通过同源重组或非同源末端连接的方法实现基因组碱基的删除、插入或突变[13]。但ZFN技术的运用有明显的局限性，载体构建难度大，对目标序列也有严格的要求，所以设计出适合的打靶位点十分困难，即使设计出合适的打靶位点，若没有高亲和性、高特异性的锌指蛋白与打靶位点结合，也十分易出现脱靶现象，使DNA发生错配和序列的改变，不仅工作量大，费用还高[14]；TALENs技术虽然对打靶位点设计要求低，选择多，但其载体构建繁琐，难度大。所以需要一种简单、高效、稳定且成本低的基因组编辑技术来改变现状。与前两种技术相比，CRISPR/Cas9技术操作更简单、成本更低、效率更高，不需要设计和构建蛋白，只需要设计sgRNA，就会产生突变并识别不同的打靶位点进而实现基因编辑[15]，实验已经证明了CRISPR/Cas9精确编辑技术在水稻中具有可行性[16-17]。利用CRISPR/Cas9系统对水稻进行基因定点突变，通过有效控制水稻基因组的修饰，进而将具有优良性状的基因整合到一起，使CRISPR/Cas9技术成为保证稻米品质，提高水稻抗逆性及产量的重要手段。本文总结了近几年CRISPR/Cas9基因编辑技术在水稻新品种培育方面的应用，详细阐述了参与水稻抗逆性调控基因的编辑、品质及熟期等农艺性状相关基因的编辑，旨在为未来提高水稻抗逆性，获得早熟品质水稻品种提供有力的理论指导。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术简介

1.1 CRISPR/Cas系统的结构

CRISPR/Cas系统的结构由CRISPR基因座和Cas基因2部分组成(图1)，CRISPR基因座由富含AT结构的300～500 bp的前导序列，其可作为启动子启动CRISPR序列调控转录出pre-crRNA和tracrRNA，包括可形成发卡结构的回文序列的重复序列 (Repeat) 和被细菌俘获的外源DNA序列(间隔序列)。分别以重复序列开始和结束，每2个重复序列之间穿入一个间隔序列，因此，重复序列的数量始终比间隔序列数量多1个。Folk酶功能与Cas蛋白十分相似，通过特异性位点识别切断入侵DNA片段，进而降解外来基因序列。目前已发现Cas1-Cas12等多个Cas蛋白[18-20]。

图1 CRISPR/Cas系统结构图[21]Fig.1 Diagram of CRISPR/Cas system structure

1.2 CRISPR/Cas系统类型及CRISPR/Cas9原理

CRISPR系统3种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[22]，3种类型都包括目标DNA、靶向crRNA和PAM序列，其中Ⅰ型CRISPR和Ⅲ型CRISPR均需要多种Cas蛋白和crRNA协同作用才能够剪切外源DNA，而II型CRISPR仅仅需要Cas9、crRNA、tracrRNA互相协作就可以发挥作用，降解外源DNA[23]，操作上具有实用性。

CRISPR/Cas9隶属于Ⅱ型CRISPR系统。其原理是反式激活crRNA和CRISPR RNA结合成双元聚合体结构，这种结构被称为单一引导RNA，引导内切酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。Cas9蛋白是一个具有RuvC核酸酶活性结构域及HNH的功能蛋白，通过识别外源DNA序列中3至6个碱基组成的具有原间隔序列的PAM (Proto-spacer adjacent motif)，对外源双链DNA序列进行切割，并引起外源DNA序列的双链发生断裂(DSB)[24]，随后，在其修复的过程中可以实现对基因组的特定位点进行DNA的缺失、插入、碱基突变以及修饰作用。

1.3 CRISPR/Cas9的编辑形式

CRISPR/Cas9的编辑形式有两种，即基因敲除形式和基因的插入或替换形式。

基因敲除是在目的基因的上下游分别设计一个引导RNA，将Cas9蛋白编码基因连接到质粒上，将连接好的质粒导入受体细胞，引导gRNA通过碱基互补配对原则靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白编码基因使该基因上下游的DNA双链发生断裂，但是由于生物体存在DNA损伤修复应答机制来保护自身免受外界不良环境的侵害，生物体会将断裂的上下游两端的基因序列重新连接起来，从而成功敲除目标基因。

基因的插入或替换，是在基因敲除技术的基础上，引入一个能自我修复的模板，细胞就按照符合预期的模板，在细胞修复过程中通过在特定位点突变或引入、插入突变片段，实现对基因的突变。其中包括两种突变形式，一种是单碱基编辑形式。单碱基编辑技术是指对目标基因片段中的特定位点的单个碱基进行替换。其工作原理是在双链不发生断裂的情况下，分别利用胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或经改造的腺嘌呤脱氨酶对靶点上一定范围内的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)进行脱氨基反应，经过DNA修复作用，最终实现A-G或C-T碱基对的精准替换。另一种是直接调控基因的表达，在CRISPR/Cas的Ⅱ型系统中将Cas9的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对DNA的切割活性，但不影响其与DNA的结合力[25-26]，这种蛋白被命名为dCas9蛋白。若dCas9蛋白能与特定的靶向基因引导RNA(gRNA)在细胞中共同表达，则gRNA介导的dCas9蛋白就会与DNA结合。若dCas9蛋白结合到靶基因编码区之内，就可以阻断RNA聚合酶的延伸作用；若结合到启动子区域则会阻止基因转录的起始过程。

2 CRISPR/Cas9在水稻中的应用

2.1 抗病水稻品种选育

稻瘟病是由稻瘟病菌产生的分生孢子侵染水稻，从而引起最具危害性的真菌病害[27]。稻瘟病可以发生在水稻生长中任何一个生育期。传统水稻抗病育种方法一般是常规育种，诱变育种和杂交育种是两个典型的代表[28]，以人工选择结合抗性鉴定为辅助，将抗稻瘟病品种中所携带的抗病基因导入目标植株，获得新的抗稻瘟病品种，此外对抗病基因分子标记的开发同样用于抗病育种辅助选择[29]。随着转基因技术的诞生，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建水稻突变体，也为培育抗稻瘟病新品种带来了新的机遇[30]。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体，转化长粒粳稻恢复系，T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变类型多为双等位突变。筛选出无转基因标记的T1代能够稳定遗传给T2代，最终获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。Li等[32]根据育种需求，利用CRISPR/Cas9编辑技术定向改造水稻性状，抑制了bsr-d1基因在水稻中的表达，使水稻植株表现出显著的抗稻瘟病特性，经过水稻抗病性试验结果证实，bsr-d1是水稻稻瘟病的一个广谱抗病性基因。

2.2 抗除草剂水稻品种选育

杂草是影响水稻产量和品质的主要因素，喷除草剂是目前经济有效的方法，但是除草剂在杀死杂草的同时也抑制了水稻的生长[33]，影响水稻生长发育的速度以及水稻的产量，所以培育抗除草剂水稻品种对提高水稻的抗逆性十分重要。目前比较快速、精准的育种方法是利用CRISPR/Cas9技术定点突变除草剂相关调控基因，获得发生等位变异的除草剂抗性基因进而创制具有除草剂抗性的水稻品种。Li等[34]根据育种需求，利用CRISPR/Cas9技术定点替换、插入水稻内源性EPSPS基因，得到了含有抗草甘膦基因的水稻材料；Sun等[35]采用CRISPR/Cas9技术，以碱基插入与替换的方式定向改造水稻基因组序列，在同一载体上将Cas9蛋白、2个gRNA和用于同源修复的模板构建到其中，然后将构建好的载体转化到水稻愈伤组织，得到含有不连续点突变ALS基因的抗除草剂水稻品种。

2.3 高品质水稻品种培育

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以提高稻米的品质。Li等[36]利用CRISPR/Cas9技术，编辑出新的Wx的等位基因。首先设计出sgRNA，启动Wxmq包含区域，在PAM的NGG位点附近有许多鸟嘌呤碱基(G)，因此使用胞嘧啶碱基编辑器进行编辑，这种编辑器在水稻中具有较高的编辑效率，通过编辑接近目标产物的氨基酸，进而控制稻米的AC含量，生产粘度低的糯米且不影响水稻的产量。周文甲等[37]利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种绥粳14的香味基因Badh2和抽穗基因Hd2进行编辑，结果表明突变体株型比绥粳14约早成熟13天，并且香味物质2-乙酰-1-吡咯啉 (2-AP)的含量也显著高于野生型绥粳14，进而成功获得早熟且有香味的稻米[38]。邵高能等[39]利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种中花11的香味基因Badh2进行编辑，对获得的转基因后代测定其香味物质2-AP的含量，野生型2-AP含量为0.07 mg·kg-1，而突变体中2-AP含量为1.2 mg·kg-1。范美英等[40]构建靶向水稻直链淀粉合成主效基因Wx的CRISPR/Cas9表达载体，通过农杆菌134进行遗传转化，对获得的转基因后代的直链淀粉含量进行测定，野生型的直链淀粉含量19.8%，3个突变体的直链淀粉含量为1.64%、2.14%与1.67%。

2.4 高产水稻品种培育

多个因素共同决定水稻的高产性状，有效穗数、穗粒数以及千粒重是决定水稻单株产量的主要因素[41-42]。水稻的穗数与水稻的分蘖能力密切相关，主要由一级和二级分蘖数共同决定。穗粒数由稻米结实率和每穗颖花数共同决定，每穗颖花数由一次枝梗数和二次枝梗数决定。千粒重受灌浆率和粒型两个因素决定，水稻粒型又由粒宽、粒厚和粒长3个因素共同决定。Shen等[43]利用CRISPR/Cas9技术对4种不同的水稻品种进行基因编辑，研究发现与野生型相比，gs3和gs3gn1a突变体的粒长和千粒重均有所增加。Li等[44]根据育种需求，利用CRISPR/Cas9技术，以中花11为试验育种材料，对GS3、IPA1、Gn1a和DEP1这4个与产量性状相关联的基因进行定向编辑，发现带有gn1a、gs3和dep1这3种基因的突变体植株的穗数、粒重和每穗粒数均增加。由于IPA1突变体基因编辑位点不同，植株表现出两种表现型，分别为分蘖减少或分蘖增多。Li等[45]根据育种需求，利用CRISPR/Cas9技术，以龙粳11为背景，选择GS3，GS9和Badh2这3个基因为靶基因进行定向编辑，通过农杆菌介导的方法获得gs3gs9badh2三基因突变体，其后代与野生型龙粳11相比，粒长增加26.4%～27.0%，单株产量增加10.8%～12.1%，千粒重增加18.3%～41.4%。

2.5 早熟水稻品种选育

我国的黑龙江省具有供水稻种植的大面积土地[46]。但是由于水稻是热带短日照的植物，所以需要对水稻的品种进行改良来适应黑龙江省日照时间长和气温低等因素的影响，传统的杂交育种对水稻品种的选育费时费力。Li等[47]利用CRISPR/Cas9技术，以水稻开花抑制因子Hd2、Hd4和Hd5为靶基因，构建CRISPR/Cas9Pubi-H载体，以不同品种为底盘获得抽穗期提前的改良品种，较为快速且经济有效的实现了水稻新品种的开发，同时促进了南方优质水稻品种的引进，加快了黑龙江省的水稻育种进程。此外，Li等[48]通过对水稻的花期基因(抽穗基因)进行编辑，发现Hd2、Hd4和Hd5是主要的开花抑制因子，Dth2和Hd18是主要的开花促进因子，Hd6和Hd16是次要开花抑制因子，Hd17是次要的开花促进因子，只有当Hd2和Hd4同时起作用时，才能检测到它们的有效性。进一步证实了开花时间是影响产量的主要因素，通过对花期基因的不同组合可以培养出高产的水稻品种。

综上所述，CRISPR/Cas9技术在水稻品种改良中得到了广泛应用，针对不同性状改良相关基因总结如表1，未来对基因功能的深入研究将极大的促进水稻分子育种的进程。

表1 水稻分子育种中应用的部分相关基因汇总Table 1 Summary of some related genes used in molecular breeding of rice

3 展 望

CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的重大发现，他可以在特定位点上切割DNA双链，诱导细胞进行自主修复，如非同源末端连接(NHRJ)或同源重组(HDR)，从而实现有效的定点基因组编辑[37]。其构建简便、精度高、周期短、成本低，能够高效地获得具有遗传稳定性的材料，为研究基因功能提供材料保障和技术支持。但目前还存在诸多的问题如：脱靶率较高，基因编辑效率较低，碱基具有偏好性，不同基因编辑位点效率不同，限制了基因编辑技术的大规模应用。尽管如此，CRISPR/Cas9技术已经在改良水稻性状和水稻分子育种上发挥了作用。而且，我国科学家已经提出了水稻“2020研究计划”和“水稻4D基因组学研究计划”[5]，相信CRISPR/Cas9技术将不断运用到水稻功能基因组研究中，通过CRISPR/Cas9技术，使水稻的多个优良基因融合表达成为可能，使水稻的产量和品质不断提高。也可以利用CRISPR/Cas9技术选育抗逆性的水稻品种，使水稻植株具有抗盐碱胁迫、冷胁迫和低温胁迫的优良性状，为水稻在更广范围内种植提供了可能性，对未来的水稻分子育种具有深远的影响。