棉铃虫唾液凝集素的初步研究

王雄雅 李星 白素芬 李欣

摘要 ：昆虫唾液在成功取食寄主中发挥关键作用。而有关植食性昆虫唾液（反吐液）的研究多集中在与寄主植物的互作关系上，鲜有涉及唾液免疫因子的研究。凝集素作为模式识别受体，在病原物的识别中发挥重要作用，是昆虫重要的免疫因子。棉铃虫幼虫血淋巴中已报道的凝集素种类至少有8种，但其唾液中是否存在凝集素却未见报道。本文通过与鸡血红细胞的血凝反应检测到棉铃虫幼虫唾液中含有凝集活性物质，凝集效价高达29。显微观察显示，唾液对鸡血红细胞具有明显的凝集作用。经35%和45%硫酸铵盐析沉淀获得的组分具有明显凝集活性，表明唾液中的凝集活性物质为蛋白质。通过糖抑制试验，发现棉铃虫唾液凝集素与其血淋巴凝集素的糖结合谱存在差异，表明他们是不同的凝集素种类。棉铃虫唾液凝集素的揭示为理解植食性昆虫唾液的免疫功能提供了新的证据。

关键词 ：凝集素; 棉铃虫; 唾液（反吐液）; 凝集活性; 糖抑制试验

中图分类号：

Q 965文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019529

A preliminary study of lectin in the saliva （regurgitant） of Helicoverpa armigera

WANG Xiongya1，2， LI Xing1， BAI Sufen1， LI Xin1*

（1. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract ：Insect saliva plays a major role in successful feeding on host. In recent years， the researches on salivary components of herbivory insects have mainly focused on the coevolution and relationships between insects and plants， and less attention have been paid to the factors involved in immunity. Lectins， as pattern recognition receptors， play important roles in recognizing foreign substances in the insect immune system. There are at least eight Ctype lectins in larval hemolymph of Helicoverpa armigera， but until now no lectin has ever been reported in its saliva （regurgitant）. In the present study， the agglutination activity of H.armigera saliva was detected by hemagglutination reaction with chicken erythrocytes. The agglutination reaction of chicken erythrocytes treated with H.armigera saliva was observed obviously under phase contrast microscope. By ammonium sulfate precipitation， the protein precipitated by 35% and 45% ammonium sulfate showed obvious agglutination activity， indicating that the substance with agglutination activity in saliva was a protein. The carbohydrateinhibition assay discovered the difference between saliva and hemolymph in carbohydratebinding profiles of lectin， suggesting that they were different lectins. The lectin identified in saliva of H.armigera adds new proof to the understanding of immunity of phytophagous insects.

Key words ：lectin; Helicoverpa armigera; saliva （regurgitant）; agglutination activity; carbohydrate inhibition agglutination test

植食性昆蟲在取食寄主植物时会分泌大量唾液，成分复杂，含有许多重要的生理功能因子，具有湿润口器、消化、解毒、免疫、化学感受，以及调控寄主植物防御反应等功能[1]。在植食性昆虫与寄主植物长期协同进化的过程中，唾液发挥着至关重要的作用。唾液成分中激发子、植食性昆虫相关模式分子和效应子等是二者之间起联系作用的纽带[2]。素有“超级害虫”之称的烟粉虱Bemisia tabaci在取食时，一种效应子Bt56随唾液进入植物韧皮部，通过与植物中的转录因子结合，诱导水杨酸信号途径来抑制抗虫物质茉莉酸分泌，从而有利于自身的生存和繁殖[3]。不同的植食性昆虫，会利用不同的唾液成分或含量来适应不同的寄主，如多食性昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera下唇腺葡萄糖氧化酶活性显著高于寡食性昆虫烟夜蛾H. assulta[1， 4]。对鳞翅目昆虫唾液的研究大多是用口腔分泌物又称反吐液，是唾液腺分泌物和肠道分泌物的混合液[5]。张帅等通过构建棉铃虫幼虫唾液腺全长cDNA文库，测序得到1 502条EST序列，而这些基因多与消化和植物互作相关[6]。也有学者对棉铃虫唾液腺和中肠内分泌液进行转录组和蛋白组学分析，发现了一些免疫相关蛋白，如溶菌酶、蛋白酶抑制剂和β1，3葡聚糖蛋白等[78]，但未提及免疫识别因子凝集素。针对当前有关植食性昆虫唾液的研究多集中在与寄主植物的互作关系，而鲜有涉及唾液免疫因子的研究现状，我们推测棉铃虫作为典型的多食性昆虫，当取食时，不仅面对来自不同寄主植物的抗虫防御反应要攻破，更要应对众多来自环境中的细菌、病毒、真菌、原生动物等病原物的侵染，其唾液中可能含有丰富的免疫因子。因此，棉铃虫唾液中有无免疫识别因子凝集素将是本文首要解决的问题。

凝集素广泛分布于动物、植物和微生物中，是一类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白[9]。作为模式识别受体，凝集素能够识别细胞膜表面的碳脂化合物决定簇，是重要的免疫识别因子。目前，已在许多种昆虫中发现有凝集素，涉及鳞翅目、双翅目、蜚蠊目、鞘翅目、直翅目等多个类群，仅果蝇基因组中就有30多种编码凝集素的基因，已分离纯化的昆虫凝集素达40余种[1011]。大多数昆虫凝集素属于C型凝集素，也是研究最多的一类模式识别受体家族，在Ca2+存在下能够特异性识别病原菌表面的糖基，引起一系列免疫反应从而有效地清除病原菌，有些甚至可以直接杀灭细菌和病毒[12]。

目前，已在棉铃虫幼虫血淋巴中发现至少8种C型凝集素，其可被病原菌诱导表达[11， 1315]。C型凝集素除了识别病原物外，还可能参与其他的生物过程，如参与蜕皮过程[16]、免疫激活[1718]、调理作用、溶血作用[19]等。因其功能的多样性，众多学者将研究的焦点集中在昆虫血淋巴中的凝集素[2023]，而对植食性昆虫唾液中凝集素的关注较少。本文首次在棉铃虫幼虫唾液中发现凝集活性物质，进一步通过糖抑制试验，对棉铃虫唾液和血淋巴中凝集素进行糖结合谱比较。以期从唾液免疫角度为多食性昆虫在取食多样性和环境适应性方面提供依据，并为进一步明确棉铃虫唾液凝集素的种类、理化特性和病原识别谱奠定基础。

1 材料与方法

1.1 昆虫采集与饲养

棉铃虫采自郑州郊区菜田，并饲养在（28±1）℃，RH（70±10）%，光周期为L∥D=14 h∥10 h的人工气候箱中。根据Zhao等[24]的配方配制的人工饲料饲养棉铃虫幼虫。用已消毒的小毛笔将初孵的棉铃虫幼虫轻轻挑到人工饲料上饲养，于3龄初进行分管单头饲养，在指形管（长8.0 cm，直径1.5 cm）中放入一长方体人工饲料，管口塞入经过消毒的棉塞。棉铃虫化蛹后，放入饲养笼内，待成虫羽化产卵。

1.2 幼虫唾液（反吐液）的提取

将棉铃虫末龄取食期幼虫用镊子轻微固定，同时用移液器吸头轻微触碰幼虫口器部位，刺激幼虫反吐唾液，并用移液器及时吸取收集到一个预冷的离心管中，加入少量晶体苯基硫脲（PTU）以防止唾液黑化。从约100头末龄幼虫中采集约1 000 μL唾液（反吐液）样品供试。在4℃下14 000 g离心10 min，收集不含固体杂质的唾液样品（上清液），储存在-20℃，备用。

1.3 幼虫血淋巴的提取

挑取约50头棉铃虫末龄取食期幼虫，用剪刀剪掉幼虫一对腹足，将血淋巴样品滴入一个预冷的离心管中，并加入少量晶体苯基硫脲（PTU）以防止血淋巴黑化。收集约1 000 μL血淋巴样品，并在4℃下，14 000 g离心10 min，收集不含固体杂质的相应样品，储存在-20℃，备用。

1.4 肠液的制备

解剖60～100头棉铃虫末龄取食期幼虫，将完整的消化道露出，用滤纸吸净血淋巴，并用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS， pH 7.4）将消化道清洗3遍并用滤纸擦干。前肠较短且肠壁较薄，可直接用移液器吸头刺破肠壁吸取收集前肠液样品。中肠肠壁较厚，将完整中肠组织的肠壁纵向剪开并置于离心管内，在4℃下8 000 g离心10 min，收集上清液。所有肠液样品均置于一个预冷的离心管中并加入少量晶体苯基硫脲（PTU）以防止肠液黑化。在4℃下，14 000 g离心10 min，收集不含固体杂质的相应样品，储存在-20℃，备用。

1.5 脊椎动物红细胞的制备

选健康鸡采集血液，在4℃下1 000 g离心10 min收集红细胞，并通过10倍体积预冷的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS， pH 7.4）清洗3遍，每次清洗后，在4℃下1 000 g离心5 min。获得的红细胞用0.01 mol/L PBS配制成2%的红细胞悬浮液用于血凝活性检测。

1.6 血凝活性测定与血凝现象观察

血凝活性测定：凝集活性通过96孔V底微量反应板进行检测，将25 μL的唾液或肠液样品在96孔V底微量反应板中通过0.01 mol/L PBS（pH 7.4）进行连续倍比稀释，然后加入25 μL 2%的鸡红细胞悬浮液混匀，室温下进行反应。用PBS做对照，每个处理重复3次。室温反应1 h后，待对照组红细胞完全沉淀，读取样品的凝集效价。以具有凝集活性的样品最高稀释倍数的倒数作为该样品的凝集效价，并作为一个凝集活性单位[25]。

血凝现象观察：预先用25 μL 2%的鸡红细胞悬浮液与用PBS连续倍比稀释的等体积唾液样品在96孔反应板中室温反应1 h。观测各孔红细胞凝集情况，将观察到有凝集现象的孔中反应混合液取出，并在Leica倒置相差显微镜下用Canon Power Shot A650 IS相机观察和拍照。用PBS代替唾液样品与鸡红细胞混匀作为阴性对照。

1.7 唾液樣品硫酸铵盐析

用饱和硫酸铵溶液分别与50 μL唾液样品混匀，使混合液中硫酸铵饱和度分别达到20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%和80%，置于冰上沉淀出唾液中的蛋白，在4℃下，14 000 g离心10 min，沉淀的蛋白用0.01 mol/L的PBS缓冲液再溶解。沉淀获得的蛋白经过透析脱盐并冷冻干燥，用50 μL 0.01 mol/L PBS重新溶解，处理后的样品通过V底微量反应板检测凝集活性。

1.8 糖抑制试验

用0.01 mol/L PBS分别配制0.3 mol/L的半乳糖、甘露糖、N乙酰葡萄糖胺、麦芽糖、L阿拉伯糖、乳糖、L鼠李糖、乳果糖和对硝基苯βD吡喃半乳糖苷（PNPG）的糖溶液。将在35%和45%硫酸铵饱和度下盐析获得的唾液蛋白透析，所获唾液蛋白样品以及幼虫血淋巴样品分别与0.3 mol/L的不同糖溶液按1∶1比例混匀，室温孵育3 h，获得不同糖处理后的样品。各样品通过V底微量反应板检测凝集活性的变化。

2 结果与分析

2.1 棉铃虫唾液凝集素的检测

棉铃虫唾液样品通过V底微量反应板法检测其凝集活性。唾液样品稀释倍数在21～24出现溶血现象，能够使鸡红细胞完全溶解，而在26～29鸡红细胞出现凝集现象。作为阴性对照的PBS，所有孔中的红细胞全部沉淀到底部。该结果表明棉铃虫唾液中存在凝集活性物质。

通过相差显微镜观察，鸡红细胞与稀释倍数在26～29的唾液样品反应后，红细胞之间出现凝集现象，唾液样品在稀释高达29倍后，依然可以检测到凝集活性（图1a），而PBS对照组红细胞分布均匀，没有凝集现象发生（图1b）。

2.2 唾液凝集素的来源

因检测的唾液样品为口腔反吐液，为明确唾液中凝集活性物质的发生来源，进一步对前肠液和中肠液进行了凝集活性测定。发现唾液和前肠液具有凝集活性，凝集效价均达到了29（图2a、b），而中肠液和PBS对照则没有凝集活性（图2c、d）。另外唾液、前肠液和中肠液在稀释21～24倍时对鸡红细胞均出现溶血現象。

2.3 唾液凝集活性物质的化学性质

唾液样品经不同饱和度的硫酸铵溶液分段盐析，在35%和45%的硫酸铵饱和度下盐析沉淀获得的样品对鸡红细胞具有较强的凝集活性，凝集效价分别为25和26。结果表明，唾液中存在的凝集活性物质为蛋白质。

2.4 凝集素的糖结合特性

凝集素通过识别异物表面糖链实现凝集活性，不同凝集素对糖链的结合谱存在差异，预先通过与不同糖分子结合处理，可使凝集素原糖结合位点被占据，阻碍其对异物表面糖链的识别，抑制凝集活性，进而说明凝集素与糖类的结合谱。经35%和45%硫酸铵盐析获得的唾液蛋白样品与血淋巴样品对糖的结合谱存在差异（表1）。麦芽糖能够抑制35%硫酸铵盐析蛋白的凝集活性，而不能抑制45%硫酸铵盐析蛋白和棉铃虫血淋巴的凝集活性。L阿拉伯糖和乳糖只能抑制棉铃虫血淋巴中的凝集素活性。而乳果糖和PNPG只对45%硫酸铵盐析蛋白凝集素有抑制作用。半乳糖和L鼠李糖则对这3种样品的凝集活性均有抑制作用。

3 结论与讨论

目前，有关昆虫凝集素的报道主要集中于血浆、血细胞、脂肪体、肌肉和体壁等多个组织和器官中，主要是由脂肪体和血细胞合成并分泌到血淋巴中[2629]。本研究证实植食性昆虫棉铃虫幼虫唾液（反吐液）中存在凝集活性物质。通过对唾液、前肠液和中肠液凝集活性分析，发现凝集素只在唾液和前肠液中存在，我们推断唾液中的凝集素可能是由棉铃虫幼虫下唇腺合成分泌的，后续我们通过对棉铃虫下唇腺转录组分析，发现了多个凝集素基因（未发表资料）。凝集素作为模式识别受体，能够最先发现并结合存在于病原物表面的糖蛋白或糖脂，这对病原物的识别和清除起着至关重要的作用[30]。

唾液是昆虫内部与外界环境接触的桥梁，唾液中存在的凝集素有利于昆虫尽早识别病原物，清除因取食所带来的病原物。唾液样品通过不同饱和度的硫酸铵盐析，获得的蛋白组分具有凝集活性，这说明唾液中存在的凝集活性物质即为蛋白质。昆虫凝集素除了受到正常生理的调控外，一些外源因素也能诱导其表达水平的变化，如病原菌、寄生虫、机械损伤和物理因子等[11， 13， 1516]。棉铃虫唾液中凝集素是否受到这些因素的影响还有待进一步研究。

凝集素能识别病原物或动物红细胞等异物，其本质就是对细胞膜表面糖链信息的识别，通过糖抑制试验即糖分子直接与凝集素糖识别结构域竞争性结合，抑制凝集素对红细胞的凝集作用，获知不同凝集素的糖结合特性。本文通过对棉铃虫血淋巴和唾液凝集素的糖结合谱进行比较，发现两者对糖的结合谱存在差异，这说明唾液中的凝集素不同于血淋巴中的凝集素。棉铃虫血淋巴中报道至少有8种凝集素，这8种凝集素不仅在结构上存在差异，其时空表达模式也有不同[11]。目前，已有多种昆虫凝集素的糖结合谱被报道，它们对糖的结合特性各有不同[14， 3132]。对糖结合谱的差异也代表了凝集素对病原物的识别谱存在差异。植食性昆虫通过唾液与复杂的外界环境直接接触，面临的病原物种类和数量可能都要高于血淋巴，这就要求唾液中应有更为丰富的凝集素来完成特定的免疫识别作用。有关棉铃虫唾液中凝集素的种类、理化特性及抗菌作用还有待进一步揭示。

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