棉花耐旱耐盐碱生理和分子机制研究进展

马盼盼, 赵曾强, 祝建波, 孙国清

(1.新疆农垦科学院生物技术研究所, 作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室, 新疆 石河子 832000；2.石河子大学生命科学学院, 新疆 石河子 832003；3.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)

随着全球气候变化，非生物环境因素对植物生长影响日趋严重，其中低温、干旱和盐碱是影响农作物生长、发育和产量的主要非生物胁迫因素[1-3]。棉花作为重要的经济作物和纺织原料，是不可或缺的战略储备物资。然而，土壤盐碱化和水资源短缺等生态环境问题造成棉花产量下降及品质变差，已成为制约棉花可持续发展的重要因素[4-5]。利用现代分子育种技术提高棉花抗逆性是解决棉花抗逆育种的有效途径。棉花基因组的测序完成以及高通量测序技术的发展为棉花耐旱耐盐等抗逆基因的功能及其分子机制提供了极大便利。研究者通过分子生物学技术和手段分离鉴定获得了大量的耐旱耐盐碱相关基因，并对其抗逆分子机理进行了探索。本文主要从干旱和盐碱对棉花的影响，棉花对干旱、盐碱胁迫的形态适应性、生理调节和分子机制，转基因耐旱、耐盐碱棉花材料的抗逆性研究进展等方面进行了阐述，以期为后续棉花抗旱耐盐碱基因工程研究提供理论参考。

1 干旱、盐碱对棉花生长发育的影响

干旱胁迫严重影响棉花的生长发育，如株高、叶片干重、叶面积指数、果节数、纤维品质、冠层及根系生长等[5]。水分胁迫下，不同棉花品种的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度及水势显著降低[6-7]。王俊娟[8]对41份陆地棉材料干旱胁迫处理前后的农艺性状和纤维品质指标进行了比较和分析，结果表明，全生育期干旱处理条件下，41份陆地棉的株高、果枝数、单株成铃数均有不同程度的降低，平均值均极显著降低，说明这些农艺性状容易受到干旱胁迫的影响。干旱胁迫使纤维品质变劣，表现为纤维长度极显著降低，整齐度极显著下降，麦克隆值极显著升高，断裂比强度极显著降低，伸长率极显著升高。

棉花虽然具有一定的耐盐性，但是不同品种间的耐盐性差异较大，而且同一品种具有生育阶段差异性。当土壤含盐量在0.2%～0.3%时，出苗困难；当土壤含盐量在0.4%～0.5% 时，种子不能出土；当土壤含盐量大于0.65%时，种子很难发芽[9]。盐胁迫可引起棉花形态和一系列生理变化，叶片和根干重、根长、根直径、叶绿素和脯氨酸含量、净光合速率和气孔导度降低[10]。长期盐胁迫可导致棉花长势下降，出叶速度减慢，果枝数减少，现蕾、开花、结铃推迟，花铃期缩短，蕾铃脱落增加，产量降低[4]。盐胁迫对棉花衣分、纤维长度影响不大，对纤维细度、强度、成熟度影响较大，棉铃发育受到抑制，纤维素含量降低，导致棉铃及纤维发育不充分[11]。

2 棉花耐旱、耐盐碱机制

棉花是耐盐性较强的农作物，其耐盐能力与盐分类型、棉花品种、棉花不同生长阶段等因素有关。当遭遇干旱和高盐胁迫时，棉花自身会从生长习性与结构方面适应胁迫环境。也可通过离子区域化分布、渗透调节物质合成与积累、膜脂过氧化清除系统等一系列生理生化调节机制来适应或抵抗干旱和高盐等非生物胁迫。

2.1 棉花耐旱、耐盐碱的形态学适应机制

植物与其生长环境是一个统一的整体，在长期的共生过程中形成了适应性的形态建成，适应性的形态结构、生理生化特征。最初的棉花耐旱性研究集中在棉花根系的系统结构和形态生理研究方面，主要通过提高根系吸收水分的能力来减轻干旱抑制作用。研究发现，干旱条件下，棉花的根系长度增加，但根系直径变小[12]，根密度增加，侧根数增加[13]，根系分布受到影响。除根系外，植物还会在干旱前期调整气孔的开度和叶片形态特征，以此来减少水分的散失[6-7]。

棉花因土壤盐分类型、基因型、生长发育阶段、器官组织的不同而表现出不同的耐盐性。研究发现，棉花对土壤中各种盐分的敏感程度依次为MgSO4>MgCl2>Na2CO3>Na2SO4>NaCl > NaHCO3[14]。种属间耐盐性差异也较大，4个栽培种中非洲棉和海岛棉的耐盐材料较多，陆地棉耐盐材料次之，亚洲棉中耐盐材料极少[15]，这与各自的起源和遗传背景有关。戴海芳等[16]通过对17份棉花品种的耐盐性评价研究发现，与盐敏感品种相比，强耐盐棉花品种幼苗在盐胁迫下相对电导率较低，净光合速率、叶绿素含量、叶面积和鲜重则能保持较高水平，且其幼苗真叶面积可达其他类别品种的近 2 倍。强耐盐棉花品种幼苗叶片在盐碱环境中受到伤害较轻，能保持较高的真叶面积和光合能力，有利于提高植株耐盐能力和光合产物积累，降低土壤中离子毒害，增强植株耐盐性。棉花不同生育阶段的耐盐性差异较大，王俊娟等[17]研究发现，萌发出苗期是盐敏感期，随着生育期的延长，棉花的耐盐性逐渐提高。

2.2 棉花耐旱、耐盐碱的生理生化调节机制

2.2.1棉花体内离子区隔化分布及离子平衡

研究表明，不同植物在盐胁迫下的耐盐机理存在差异。盐胁迫下，棉花体内以Na+为主要毒害因子[18]，耐盐性不同的棉花根、茎、叶内Na+积累量存在显著差异。相同NaCl浓度处理下，耐盐材料根中的Na+含量高于地上组织器官，而地上组织能维持相对较高的K+、Ca2+、Mg2+含量和较低的Na+/K+，表明根系能积累一部分的Na+，从而减轻Na+对地上组织的损伤[19-20]。这说明棉花品种的耐盐性是通过盐分在地上部的区隔化分布实现的。盐离子在细胞内的区域化分布也是植物耐盐的重要机理。盐胁迫条件下，Na+在细胞内超量积累，而耐盐品种则具有将Na+液泡区域化和Na+外排能力来降低Na+在细胞质中的浓度[21]。Wu等[22]克隆出了液泡膜上Na+/ H+逆向转运蛋白基因，通过转基因的方法证明棉花的耐盐性与GhNHX1基因的表达有关。可见，棉花也可能存在将Na+离子排出胞外或将Na+区隔化到液泡中等离子的区域化分布机制。

2.2.2渗透调节 干旱和高盐等胁迫条件均能导致植物细胞水分亏缺，诱发渗透胁迫，造成根系细胞脱水，叶片萎蔫，进而影响植物的生理功能。植物细胞主要通过无机离子和小分子有机物质的积累、运转及区域化等机制解除渗透胁迫[23]。这些有机物质如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、甘露醇、海藻糖等，有助于保护蛋白质和膜免受干旱胁迫下高浓度无机离子和氧化损伤的损害[24]。近年来，研究者将渗透调节物质脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、海藻糖等合成途径关键酶基因转入棉花，证明这些小分子物质在棉花耐旱、耐盐碱中具有重要作用[25-27]。转胆碱脱氢酶基因 (betA) 棉花中甘氨酸甜菜碱积累使得植株的光合作用提高，相对含水量增加，渗透调节能力增强，膜脂过氧化降低，离子渗透率降低，进而增强棉花的抗旱能力[28]。过表达基因GhAN1可通过增强超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及脯氨酸和可溶性糖的含量来提高棉花的抗旱耐盐能力[29]。因此，渗透调节也是棉花耐旱、耐盐碱的重要机制之一。

2.2.3抗氧化胁迫 植物在正常新陈代谢活动中和逆境环境条件下均会产生活性氧，在正常条件下，活性氧可以激活转录因子，促进细胞分裂和分化。当干旱和盐胁迫出现时，植物体内便会产生和积累大量的活性氧，进而破坏很多生物学过程[30]。植物在长期进化中形成了能清除氧化活性的酶系和抗氧化物质来抵抗氧化胁迫[31]。抗氧化酶类有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbic peroxidase, APX)。非酶类抗氧化物质有维生素、辅酶Q、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)等。研究发现，抗氧化酶和非酶类抗氧化物质在活性氧清除过程中协同工作[32]。起初，抗氧化防卫系统研究集中在酶促活性方面，为了解释不同环境胁迫诱导的氧化胁迫响应的抗氧化保护机制，研究者对SOD、POD、APX及CAT 等酶进行大量研究。抗氧化酶基因功能的研究为植物抗氧化防卫系统的研究开启了思路。棉花中18个SOD基因在不同非生物胁迫下的表达模式研究显示，SOD 基因家族在活性氧清除中具有重要作用[33]。过表达基因GhSOD1和GhCAT可增强棉花的耐盐能力[34]。

2.3 棉花耐旱、耐盐碱分子机制研究进展

关于棉花耐旱、耐盐碱分子机制研究，主要通过抗逆相关的基因克隆和功能解析来实现。耐旱、耐盐碱是由多基因控制的数量性状，其生理、生化过程是基因相互作用、共同调节的结果，涉及多条信号传导途径。

2.3.1ABA信号途径 干旱胁迫主要引起渗透胁迫，而盐胁迫则同时对细胞造成渗透胁迫和离子毒害。因此，干旱胁迫和盐胁迫有各自独立和一些共同的信号转导机制。干旱和盐胁迫的一个重要特征是渗透胁迫信号能够引起植物激素脱落酸 (abscisic acid, ABA) 的累积，进而引起植物的适应性反应[35]。与其他植物一样，棉花对ABA信号的感知和信号转导有ABA依赖和ABA非依赖两条途径介导[36]。ABA依赖信号途径在各种胁迫条件，尤其是在渗透胁迫下应答基因的表达中起关键作用。ABA受体是ABA信号转导的重要元件。正常条件下，ABA水平很低，蔗糖非酵解相关蛋白激酶2 (SnRK2) 的活性被蛋白磷酸酶2C(PP2C) 抑制。当植物遭受干旱、盐碱等胁迫刺激时，ABA与受体PYL结合并激活PP2C，形成ABA-PYL-PP2C三元复合体，使得SnRK2s从PP2Cs的结合中释放出来[37]。释放的SnRK2s通过自身磷酸化激活，并磷酸化下游的钾离子通道蛋白和ABF/bZIP等转录因子使它们被激活，从而调节胁迫诱导基因的表达、气孔的开闭和离子转运等[38]。

近年来，棉花中也进行了ABA受体蛋白PYL、蛋白激酶SnRKs和蛋白磷酸酶PP2C基因的相关研究。Chen等[39]在陆地棉中鉴定了27个ABA受体蛋白PYL，研究结果显示，棉花PYL基因可能参与干旱/渗透胁迫响应；陈云[40]通过转录组分析，在棉花中分离鉴定了一个PP2C家族基因GhDRPP1(CotAD_18479)，该基因受干旱胁迫诱导表达，进一步研究结果表明，GhDRPP1蛋白可能通过参与脱落酸及赤霉素信号通路等多种激素信号转导途径，影响气孔关闭、光合作用等，从而在棉花干旱胁迫应答中起负调控作用；Liu 等[41]在陆地棉基因组中鉴定获得了20个SnRK2基因，一些基因对干旱、高盐及ABA处理在转录水平上响应；Bello等[42]在陆地棉中克隆了1个蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK2基因，超表达该基因的拟南芥植株表现出了耐旱性和耐盐性。

2.3.2MAPK信号途径 在植物长期进化过程中，形成了适应环境胁迫的一系列分子调控网络，如，胁迫识别、信号传导及胁迫相关基因的表达等。MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号级联途径将细胞外信号刺激转导至细胞内，从而引起相应的生理生化反应，在适应过程中起重要的枢纽作用。一个MAPK盒至少包含MAPKKK、MAPKK和MAPK三种蛋白激酶，它们之间通过磷酸化顺序激活[43]。大量研究表明，MAPK级联信号途径广泛参与干旱、高盐等多种非生物胁迫信号途径。近年来，研究者在棉花中也克隆鉴定了一些耐旱耐盐碱MAPK途径基因。Li 等[44]利用同源克隆的方法在陆地棉中克隆了2个MAPK基因，GhMPK6a和GhMPK20，其上游激活基因为GhMKK4，且转基因烟草对高盐和干旱的敏感性增强。GhMPK2转基因植株的耐盐性获得提高，主要表现在渗透调节物质脯氨酸含量升高[45]。基因GhMP3K40的过表达植株的种子萌发时期对盐和干旱的耐受性提高，转基因植株中抗逆相关基因DREB、AREB、Osmotin和抗氧化系统被激活，表明该基因正调控防卫反应，但是通过负调控生长和发育来降低对生物和非生物胁迫的耐受性，且该基因与GhMPKK4、GhMPK4和WRKY10互作[46]。Wang等[47]通过转录组、过表达以及RNAi基因GhMKK3研究干旱胁迫下棉花MAPK信号途径的具体调控机制，结果表明，GhPIP1和GhMPK7是GhMKK3的下游作用基因，在烟草中过表达GhMKK3能促进根生长和ABA诱导的气孔关闭，耐旱性获得提高，而沉默该基因之后，植株对干旱更加敏感。蛋白激酶基因GhCIPK6被盐、干旱和ABA处理诱导，过表达该基因的拟南芥植株耐旱性、耐盐性增强[48]。

2.3.3转录因子 植物中参与耐旱、耐盐碱的转录因子主要有AP2/ERF、WRKY、MYB、bZIP、NAC、锌指蛋白等类型，这些转录因子已在棉花中证明具有抗旱耐盐碱功能。过表达bZIP类转录因子GhABF2能够提高转基因棉花植株的耐旱、耐盐碱能力[49]。GhWRKY17参与ABA信号途径、干旱和高盐反应[50]，GhWRKY41受干旱和盐胁迫诱导[51]。植物中的MYB蛋白多数属于R2R3-MYB亚家族，在控制植物发育、生物和非生物胁迫应答等过程中发挥着重要作用。Chen等[52]通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)和过量表达转基因烟草研究R2R3-MYB转录因子基因GbMYB5在抗旱胁迫中的功能及其相应机制，阐明MYB转录组因子在植物抗旱胁迫中的作用及其调控机制。李付广团队根据水分胁迫下的转录组数据和实时定量PCR从亚洲棉中获得了2个能提高棉花抗旱和耐盐能力的 R2R3-MYB 转录因子基因GaMYB62L和GaMYB85，过表达GaMYB62L和GaMYB85的拟南芥株系种子在盐胁迫和渗透胁迫条件下均表现出较高的种子萌发率；且过表达这 2 个基因都可以增强植株对干旱和盐胁迫的耐受性[53-54]。

虽然己有较多分子生物学方面的报道，但是仍然无法全面阐述棉花耐旱、耐盐分子机理，因此，深入研究棉花耐旱耐盐响应机理与其他植物的耐旱、耐盐特性之间的共性，有助于利用分子生物学的方法提高棉花的耐旱、耐盐性。同时，近年来，随着棉花基因组的测序完成以及高通量测序技术的发展，将为棉花耐旱、耐盐分子机理和功能基因研究提供极大便利。

3 转基因耐旱、耐盐碱棉花

我国科学家在耐旱、耐盐碱改良等抗逆性状转基因棉花研究方面取得了很大进展，鉴定克隆获得了大批优良的耐旱、耐盐基因；筛选出了能够运用于大规模农杆菌介导转化的棉花受体材料，并建立了大规模农杆菌介导棉花遗传转化体系；对基因枪轰击、花粉管通道介导、茎尖或芽尖转化、农杆菌液浸染和纳米载体花粉介导等不同转化技术进行了探索。通过各种转化途径将优异耐旱、耐盐基因导入棉花中，获得了耐旱、耐碱性提高的棉花材料(表1)，为深入研究棉花耐旱、耐盐碱分子机制奠定了基础，同时也为棉花耐旱、耐盐碱育种提供了新的种质材料。从表1可知，用于遗传转化获得耐旱、耐盐棉花材料的基因主要来自其他一些耐旱、耐盐性较强的物种，而棉花自身的耐旱、耐盐基因转化案例相对比较少。耐旱、耐盐碱基因主要有转录因子、渗透保护和渗透调节蛋白、氧化胁迫及水分胁迫相关蛋白、参与离子区域化的Na+/H+逆向转运蛋白等。研究者主要以当地主栽品种为受体材料，通过农杆菌介导转化法和花粉管通道介导转化法，获得不同基因的耐旱耐盐材料，这些材料可以作为后续遗传育种材料。

4 展望

随着生物技术的发展，研究者从分子水平上分析生物与环境之间的关系，挖掘优异基因，利用基因工程手段结合传统育种方法，培育出了大量性状和性能改善的农作物新品种。与传统育种方式相比，通过基因工程手段引入外源基因来改变植物性状，从而使获得棉花新品种的方法更加便捷。我国科学家在棉花抗虫、抗除草剂、抗旱耐盐碱、抗病以及纤维品质改良等性状分子改良方面取得重大成果，尤其是转基因抗虫、抗除草剂棉花新品种的获得和大规模应用。然而，基因工程技术受目前研究水平的限制，基因插入的随机性、多拷贝性、表达的不稳定性，以及对受体材料基因型的依赖性，使得转基因植物的效果和期望值之间存在一定差距。虽然在棉花耐旱耐盐碱等非生物胁迫研究方面取得了很大进步，但是仍存在很多亟待解决的问题。

一是对棉花耐旱耐盐碱等非生物逆境胁迫的分子机制研究还不够透彻。由于植物的耐盐、耐旱等非生物胁迫是由多基因控制的数量性状，其生理生化过程是基因相互作用、共同调节的结果。尽管已从棉花或其他抗逆性较强的生物资源中分离鉴定了许多抗逆相关基因，但真正具有应用价值的基因还很少。且棉花抗旱耐盐碱基因工程研究多集中在单个基因功能研究方面，对改变棉花体内抗逆信号传导途径及所涉及的代谢网络缺乏系统性研究，因此，很难全面揭示棉花的抗逆分子机理。棉花基因组测序已经完成,通过整合比较转录组学、定量蛋白质组学、表型组学及全基因选择育种技术，分析鉴定抗旱耐盐碱SNP标记、抗旱耐盐碱关键基因及其调控途径，全面解析棉花抗旱耐盐碱的分子机制。同时，利用多基因聚合手段，实现基因抗性的叠加。

二是外源基因在转基因棉花中能否表达，以及在其后代材料中是否能够稳定遗传是转基因棉花抗逆研究的关键。目前，研究获得的转基因棉花主要是通过花粉管通道法和农杆菌介导转化法获得的。这两种转基因技术尚无法实现外源基因定点、定量插入棉花受体材料基因组中，且外源基因向子代传递的过程中容易产生基因丢失、沉默、重组及扩增等现象，导致外源基因的表达不稳定，转基因植株的抗性水平与预期存在一定差距。

三是对棉花种质资源的抗旱、耐盐碱缺乏系统地鉴定与评价。目前，棉花抗旱耐、盐碱种质资源鉴定以实验室、旱棚和盐池为主，而对实际田间生产环境下的选标准及精准鉴定方面缺乏系统性研究。因此，需要广大研究人员广泛收集、整理抗旱耐盐碱棉花种质资源，在不同生态植棉区进行全生育期精准鉴定，制定棉花抗旱耐盐碱进准鉴定技术指标和体系。同时，整合多组学技术、全基因组选择技术，分离鉴定抗旱耐盐碱关键基因。利用回交转育、分子标记辅助育种及分子聚合育种手段创制适合不通过生态区域的抗旱耐盐碱棉花材料，为棉花抗旱耐盐碱改良育种提供优异种质资源。