伏立康唑血药浓度监测及其在血液系统肿瘤患者用药指导中的应用

张文娟，姚 瑶，强 琼，杨 乐，刘琳娜（中国人民解放军空军军医大学第二附属医院药剂科，陕西 西安 710038）

伏立康唑是新一代三唑类抗真菌药物，其抗菌谱广，抗菌作用强，越来越多的用于曲霉菌、新型隐球菌、念珠菌等真菌感染的治疗，被各大指南推荐作为侵袭性曲霉菌病的首选药物。伏立康唑的疗效、不良反应与血药浓度相关，研究[1-3]表明，食物、年龄均可影响其血药浓度，且伏立康唑治疗窗较窄，药物暴露量与CYP2C19的基因多态性具有显著相关性，又与多种药物之间存在相互作用，这些都可影响其疗效和安全性。伏立康唑具有非线性动力学特征，同一剂量下患者的血药浓度会有不同，因此对其实施血药浓度监测具有重要意义。近年来，多个指南均推荐对伏立康唑进行血药浓度监测，以达到临床安全有效的目的，基于此，我们建立了运用反相高效液相色谱法测定血清中伏立康唑药物浓度，对我院2017年7月 -2019年11月血液科460例住院患者的611个标本进行了伏立康唑血药浓度的监测和分析，旨为临床安全合理用药提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-2030液相色谱仪（日本岛津仪器公司），Inertsil ODS-3色谱柱（日本 GL Sciences公司），MX-S旋涡混合器[大龙兴创实验室仪器（北京）有限公司]，MiniSpin离心机（德国Eppendorf公司），KH5200PV型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司），电子分析天平（十万分之一）（德国Sartorius公司），Milli-Q Advantage A10超纯水机（德国默克密理博公司）。

1.2 试剂

伏立康唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100862-201402）；酮康唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100294-201203）；甲醇和乙腈（色谱纯，Fisher公司）；冰醋酸为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；三乙胺为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。空白血清由唐都医院输血科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈 : 冰醋酸-三乙胺缓冲液 = 45∶55（v/v），流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL；室温25 ℃；紫外检测波长255 nm。

2.2 标准溶液和内标溶液的配置

2.2.1 伏立康唑标准溶液的配制精密称定伏立康唑标准品77.59 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，储备液于4 ℃保存备用。

2.2.2 内标溶液的配制精密称定酮康唑对照品107.61 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，储备液于4 ℃保存备用。

2.3 血清样品处理方法

取血清450 μL，加入不同浓度的伏立康唑工作液30 μL和内标溶液20 μL，漩涡30 s混匀，加入乙腈溶液500 μL，漩涡3 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察患者血清按照“2.3”项下方法进行预处理，进样得色谱图。伏立康唑和血清杂质及内标之间分离良好。详见图1。

图1 HPLC色谱图A-空白血清，B-空白血清 + 伏立康唑标准品 + 内标，C-患者血清；1-伏立康唑，2-酮康唑（内标）Fig 1 HPLC chromatogramA-blank serum, B-blank serum + voriconazole standard + internal standard, C-serum of patients; 1-voriconazole, 2-ketoconazole(internal standard)

2.4.2 标准曲线线性关系考察取空白血清450 μL，共7份，分别加入不同浓度的伏立康唑标准溶液，使伏立康唑的药物浓度分别为0.097、0.58、1.46、2.93、5.85、11.69、23.38 μg·mL-1，按“2.3”项下方法处理。按照“2.1”项下方法测定。测定结果以伏立康唑浓度（X）为横坐标，伏立康唑与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，用最小二乘法作线性回归，得到血清中伏立康唑浓度回归方程：Y= 0.029 5X-0.003 8，r= 0.999 0。血清中伏立康唑在0.097～23.380 μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4.3 回收率试验取浓度分别为0.58、5.85、23.38 μg·mL-1伏立康唑工作液各5个样品。按“2.3”项下方法处理后进样分析。取含量相同的伏立康唑工作液直接进样分析，计算伏立康唑在血清中的提取回收率，用回归方程计算方法回收率，详见表1。

表1 回收率试验结果Tab 1 Results of recovery test

2.4.4 精密度试验配制上述回收率考察试验中的3个浓度伏立康唑血清样品，分别在同日内不同时间点和不同日处理后进样分析，计算日内精密度和日间精密度，低、中、高三个浓度的日内和日间精密度分别为0.89%～4.47%和0.72%～4.22%。

2.4.5 稳定性试验1）血清样本室温放置稳定性：配制伏立康唑浓度分别为0.58、5.85、23.38 μg·mL-1血清样品，于室温下放置，分别在配制后的2、4、6、8 h处理后进样分析。伏立康唑低、中、高三种浓度血清样本，室温放置稳定性的RSD为0.96%～1.22%。2）血清样本冻融稳定性：配制伏立康唑浓度分别为0.58、5.85、23.38 μg·mL-1血清样品，于-20 ℃冰箱冰冻保存，分别在第0、3、7、14 d解冻测定，考察伏立康唑低、中、高3种浓度血清样品，冻融稳定性的RSD为1.16%～8.42%。

2.4.6 重复性考察取低、中、高三个浓度血清样品，按“2.3”项下方法平行处理后分别连续进样分析5次。结果显示伏立康唑和酮康唑峰面积比值的RSD为0.12%～8.37%。

2.5 血液肿瘤患者伏立康唑血药浓度测定结果

应用上述方法对2017年7月- 2019年11月在我院血液科住院的460例患者的611个标本进行了伏立康唑血药浓度测定。460例患者中男性比例为55.65%，女性比例为44.35%，临床诊断包括急慢性淋巴细胞白血病、急慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤以及再生障碍性贫血。给药方式包括口服（164例次）和静脉滴注（447例次），所有用药均用于预防或治疗肺部真菌感染，药物未区分生产厂家。相关指南[4]指出，监测稳态谷浓度具有良好的临床意义，伏立康唑给予负荷剂量时第3天达稳态血药浓度，未给予负荷剂量的则在第5～7天达稳态血药浓度。本实验所有标本均严格按照要求，在血药浓度达稳态后的第一次给药前30 min内采集，本监测结果表明血药浓度能够达到指南推荐的1.0～5.5 μg·mL-1的患者比例为67.10%（表2）；男性血药浓度与女性相比相差不大（表3，P＞ 0.05）；大于60岁老年患者血药浓度总体水平较高（表4），这可能与老年人代谢缓慢有关；口服给药和静脉给药血药浓度有显著性差异，静脉给药血药浓度总体水平较高（表5，P＜ 0.01）。

表2 血药浓度分布情况Tab 2 Distribution of serum drug concentration

表3 不同性别患者血药浓度情况Tab 3 Serum drug concentration in different gender

表4 不同年龄组血药浓度情况Tab 4 Serum drug concerntration in different age groups

表5 不同给药方式血药浓度情况Tab 5 Serum drug concerntration of different ways of administration

3 讨论

目前，国内外进行伏立康唑血药浓度监测的方法有超高液相、串联质谱、固相萃取-HPLC法、酶免疫放大法等[5-9]，超高液相以及串联质谱的速度、灵敏度和分离度都较高，非常适合复杂组分及微量元素的测定，但这两种仪器的固定资产投入较大，不利于临床推广；固相萃取技术作为样品前处理方法，已普遍应用于实验中，能有效的将标的物质与杂质分离，但该法相对于蛋白沉淀法耗时过长。以服务临床为目的，不仅要做到高效、准确，还要做到快速和便于推广，故本研究选择了高效液相色谱法。

在方法学建立过程中，笔者比较了应用甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白的提取方法，乙腈沉淀蛋白处理的组织样品无杂质，药物提取回收率高。此外还考察了血清与血浆中内源性物质对伏立康唑浓度监测的影响，发现血浆样品中内源性物质对伏立康唑有明显干扰，导致二者分离度差，所以采用血清样本进行测定。

伏立康唑的分子结构中含有三唑环、吡啶环等碱性基团，在流动相中加入一定比例的三乙胺，不仅可以调节流动相的pH值，还可作为扫尾剂，防止色谱峰的拖尾，改善峰形[10]。

本研究所测定的患者血样为血液肿瘤患者样本，此类患者用药最突出的特点就是合并用药多，采用本研究建立的方法分离度好，能够很好的排除合并用药的干扰，使得目标药物与内标的分离度良好。因此本研究建立的方法具有实用性强、操作简便、数据准确、灵敏度高、重复性好的特点，可作为伏立康唑血药浓度日常监测方法，为临床合理安全用药提供有力的保障。目前国内外研究结果表明，伏立康唑药动学个体差异大，且临床疗效和不良反应与血药浓度显著相关[11-17]，故指南建议，在给药4～7 d后应监测伏立康唑血药谷浓度，以指导剂量调整，使谷浓度水平达到有效治疗范围[17]，根据国外指南推荐伏立康唑可能的安全浓度范围为1.0～5.5 μg·mL-1，研究表明，当谷浓度高于1 μg·mL-1时，疗效增加，当谷浓度≥4 μg·mL-1，神经毒性增加，谷浓度≥ 5 μg·mL-1，肝毒性增加，因此谷浓度范围在1.0～5.5 μg·mL-1可以实现疗效最大化、不良反应最小化，本研究测定的标本67.10%谷浓度达到该范围，对于未达标的原因还应做更进一步的探索。血液肿瘤患者免疫功能低下，病原菌及感染灶不明确，临床上通常采用经验性治疗。经验用药使患者获益的同时也存在风险，如抗感染效果欠佳，不良反应发生率升高等。因此，建议临床应结合病原学检查结果及时调整抗菌药物的使用，并根据血药浓度优化给药策略，实现精准治疗[18-20]。