基于TLR4/NF-κB分析“金汁”粪菌移植干预溃疡性结肠炎小鼠的机制

吴成成 罗文兵 肖慧荣 谢昌营 胡丽霞 崔曼曼 张磊昌

【摘要】 目的：基于TLR4/NF-κB探讨“金汁”粪菌移植（FMT）干预溃疡性结肠炎（UC）小鼠的机制。方法：选取29只野生型雄性清洁级C57BL/10小鼠为研究对象。随机选取7只作为对照组，其余22只大鼠采用葡聚糖酸钠诱导法建立野生型小鼠UC模型。将这22只大鼠分为造模对照组（n=12）和FMT干预组（n=10），分别给予PBS液、粪菌液灌肠干预处理。另选取5只野生型雄性清洁级C57BL/10小鼠作为粪菌移植供体来源。观察三组小鼠结肠组织TLR4、NF-κB（p65）表达水平，观察三组小鼠结肠组织中下游细胞因子表达水平，分析TLR4、NF-κB（p65）及下游各细胞因子水平与疾病活动指数（DAI）和组织病理评分（HPS）的关系。结果：干预前，对照组DAI低于造模对照组和FMT干预组（P<0.05），造模对照组与FMT干预组DAI比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预后，造模对照组DAI高于对照组和FMT干预组，FMT干预组高于对照组（P<0.05）。FMT干预组干预后DAI低于干预前（P<0.05）。造模对照组HPS高于对照组与FMT干预组，且FMT干预组高于对照组（P<0.05）。造模对照组结肠长度短于FMT干预组与对照组，FMT干预组短于对照组（P<0.05）。造模对照组TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8及Tfh均高于对照组和FMT干预组，FMT干预组均高于对照组（P<0.05）。FMT干预组Tfr水平高于造模对照组与对照组，造模对照组高于对照组（P<0.05）;造模对照组Tfh/Tfr水平高于对照组与FMT干预组，对照组高于FMT干预组（P<0.05）。TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr與DAI、HPS均呈正相关（P<0.05），Tfr与DAI、HPS均呈负相关（P<0.05）。结论：FMT可通过下调TLR4/NF-κB信号通路的表达，进而下调TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr表达水平，达到改善UC的临床症状。

【关键词】 TLR4/NF-κB 溃疡性结肠炎 粪菌移植

Based on TLR4/NF-κB Analyze the Mechanism of “Jinzhi” Fecal Microbiota Transplantation in Mice with Ulcerative Colitis/WU Chengcheng， LUO Wenbing， XIAO Huirong， XIE Changying， HU Lixia， CUI Manman， ZHANG Leichang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（31）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the mechanism of “Jinzhi” fecal microbiota transplantation （FMI） in mice with ulcerative colitis （UC） based on TLR4/NF-κB. Method： A total of 29 wild-type male clean grade C57BL/10 mice were selected as the research objects. 7 rats were randomly selected as the control group， and the other 22 rats were used to establish the wild-type mouse model of UC induced by dextran sulfate sodium. The 22 rats were divided into modeling control group （n=12） and FMT intervention group （n=10）， and were treated with PBS solution and faecal bacteria solution enema， respectively. Another 5 wild-type male C57BL/10 mice were selected as the donor source of faecal bacteria transplantation. The expression levels of TLR4 and NF-κB （p65） in colon tissues of mice in the three groups were observed， and the expression levels of cytokines in the middle and downstream of colon tissues of mice in the three groups were observed， and the relationship between TLR4， NF-κB （p65）， cytokines in the downstream and disease activity index （DAI） and hihiopathological score （HPS） was analyzed. Result： Before intervention， DAI in the control group was lower than those in the modeling control group and the FMT intervention group （P<0.05）， and there was no significant difference in DAI between the modeling control group and the FMT intervention group （P>0.05）. After intervention， DAI in modeling control group was higher than those of the control group and FMT intervention group， while FMT intervention group was higher than that of the control group （P<0.05）. DAI in FMT intervention group after intervention was lower than that before intervention （P<0.05）. The HPS of the modeling control group was higher than those of the control group and the FMT intervention group， and the FMT intervention group was higher than that of the control group （P<0.05）. The colon length of the modeling control group was shorter than those of the FMT intervention group and control group， and that of the FMT intervention group was shorter than that of the control group （P<0.05）. TLR4， NF-κB （p65）， TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8 and Tfh in modeling control group were higher than those in control group and FMT intervention group， while those in FMT intervention group were higher than those in control group （P<0.05）. The Tfr level of FMT intervention group was higher than those of the modeling control group and control group， and that of the modeling control group was higher than that of the control group （P<0.05）. The level of Tfh/Tfr in modeling control group was higher than those in control group and FMT intervention group， and that in control group was higher than that in FMT intervention group （P<0.05）. TLR4， NF-κB（p65）， TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8， Tfh and Tfh/Tfr were positively correlated with DAI and HPS （P<0.05）， while Tfr was negatively correlated with DAI and HPS （P<0.05）. Conclusion： FMT can improve the clinical symptoms of UC by down-regulating the expression of TLR4/NF-κB signaling pathway， and then down-regulating the expression levels of TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8， Tfh and Tfh/Tfr.

[Key words] TLR4/NF-κB Ulcerative colitis Fecal microbiota transplantation

First-authors address： Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.001

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性炎症性肠病，其病因和发病机制尚未完全明确，多数学者认为与环境、遗传以及菌群失调等因素有关[1-2]。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是启动炎症反应和免疫应答的重要受体，TLRs介导的信号转导途径中TLRs/NF-κB通路可调节肠黏膜中炎症因子的表达水平，从而干预肠黏膜的炎症反应[3]。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是指通过健康人群的粪便提取功能菌群，再移植到患者消化道，重建肠道菌群的治疗方式[4]。笔者的理论研究表明，中药“金汁”与FMT乃源流之别，后者可视为对前者的继承与创新，FMT乃是一种新“金汁”[5]。FMT在治疗UC方面取得了一定的疗效，笔者的前期动物实验也证实了这一点[6]，但对于FMT治疗炎性肠炎的具体机制仍不了解[7]。因此本文利用FMT干预对UC模型小鼠进行治疗，基于TLR4/NF-κB信号通路探讨FMT干预UC小鼠的作用机制，进一步为临床利用“金汁”粪菌移植治疗UC提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取29只野生型雄性清洁级C57BL/10小鼠为研究对象，周龄6～8周，平均体重（21.6±2.8）g，小鼠均由江西中医药大学实验动物科技中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模方法 随机选取7只作为对照组，其余22只大鼠采用葡聚糖酸钠诱导法建立野生型小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型。将这22只大鼠随机分为造模对照组（n=12）和粪菌移植（FMT）干预组（n=10），分别给予PBS液、粪菌液灌肠干预处理。另选取5只野生型雄性清洁级C57BL/10小鼠作为粪菌移植供体来源。给予造模小鼠5%葡聚糖硫酸钠蒸馏水饮用饲养5 d，之后改为正常饮用水饲养10 d;反复进行上述操作3个循环后建立小鼠慢性UC模型。

1.2.2 粪菌液制作方法 取供体小鼠新鲜粪便标本，按7︰15（g/mL）溶于无菌PBS溶液中，分别采用2.0、1.0、0.5、0.25 mm不锈钢筛过滤，过滤后离心机离心旋转，6 000×g，离心15 min后取菌体，无菌PBS缓冲液冲洗3次，再重新置于25 mL PBS溶液中制成粪菌液，放置在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 干预方法 对照组给予正常饮用水和常规饲料喂养，不进行其他处理。造模对照组腹腔注射4%水合氯醛（10 μL/g）麻醉，将石蜡油涂于内径2 mm塑料软管上，并将软管经小鼠肛门插入结肠，插入约4 cm，使小鼠倒立并缓慢注射0.2 mL PBS溶液，注射完毕后拔出软管，棉球按压小鼠肛门，使小鼠保持倒立1 min后放回笼中。灌肠频率2次/d，持续2周。FMT干预组小鼠给予0.2 mL粪菌液灌肠，灌肠方式同造模对照组，灌肠频率2次/d，持续2周。

1.2.4 TLR4、NF-κB（p65）表达水平检测方法 采用颈椎脱臼法处死三组小鼠，U形切口剖开小鼠腹部，取出全部结肠组织。选择适量结肠组织经10%甲醛溶液固定后石蜡切片，制作病理标本。采用免疫组化染色分析结肠组织TLR4、NF-κB（p65）表达水平。结肠组织石蜡包埋后进行4 μm厚连续切片，采用SABC法进行免疫组织化学染色。一抗：1︰100兔抗鼠NF-κB（p65）;二抗：生物素化山羊抗鼠IgG二抗工作液，均由武汉博士的生物科技有限公司提供。免疫后每张切片随机选取5个视野，利用400倍光镜进行摄片，通过Image-Pro Plus 5.1图像分析系统对结肠组织TLR4、NF-κB（p65）的表达情况进行定量分析。

1.2.5 细胞因子水平检测方法 采用酶联免疫吸附法（ELISA）对三组小鼠细胞因子水平进行检测，具体操作按试剂盒说明书进行操作。

1.3 觀察指标及判定标准 （1）对比三组干预前后疾病活动指数（disease activity index，DAI）。采用人类炎性肠病疾病活动指数计算小鼠DAI，包括体重变化、大便性状、便血程度三个方面，DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3[8]。（2）对比三组组织病理评分（histopathological score，HPS）及结肠长度。采用Delelman等[9]的评分方法评估小鼠HPS，包括炎症程度、隐窝破坏、病变深度和病变范围四个方面。（3）对比三组结肠组织TLR4、NF-κB（p65）表达水平及细胞因子表达水平。细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、脾脏组织滤泡辅助性T细胞（T follicular helper，Tfh）及滤泡调节性T细胞（T follicular regulatory，Tfr）水平。（4）分析TLR4、NF-κB（p65）以及各细胞因子水平与DAI与HPS的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。采用Pearson进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组干预前后DAI对比 干预前后，三组DAI比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;干预前，对照组DAI低于造模对照组和FMT干预组（P<0.05），造模对照组与FMT干预组DAI比较，差异无统计学意义（P>0.05）。干预后，造模对照组DAI高于对照组和FMT干预组，FMT干预组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。FMT干预组干预后DAI低于干预前（P<0.05），对照组与造模对照组干预前后DAI比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 三组HPS评分和结肠长度对比 造模对照组HPS高于对照组与FMT干预组，FMT干预组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。造模对照组结肠长度短于FMT干预组与对照组，FMT干预组短于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 三组TLR4、NF-κB（p65）以及各细胞因子表达水平对比 造模对照组TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8及Tfh均高于对照组和FMT干预组，FMT干预组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。FMT干预组Tfr水平高于造模对照组与对照组，造模对照组高于对照组（P<0.05）;造模对照组Tfh/Tfr水平高于对照组与FMT干预组，对照组高于FMT干预组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 TLR4、NF-κB（p65）以及各细胞因子与小鼠症状的关系 TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr与DAI、HPS均呈正相关，Tfr与DAI、HPS均呈负相关（P<0.05），见表4。

3 讨论

UC属于炎症性肠炎，有学者提出UC的发病机制可能为环境因素导致易感人群在肠道菌群失调情况下，激活了肠道免疫和非免疫系统，引起肠道免疫反应，促进炎症的发生和发展，最终形成UC[10-11]。肠道菌群是维持人体肠道免疫功能的重要角色，相对于人体来说是一种免疫机制。近年来越来越多学者转向对肠道微生态的研究[12-14]。“金汁”是我国中医里的中药之一，早在东晋时期《肘后备急方》中就有记载，明代的《本草纲目》中也有利用粪便治疗疾病的记载[15]。粪菌移植是近年来兴起的现代医学治疗方法，与中医里的“金汁”有异曲同工之妙。张佳佳等[16]研究发现，FMT治疗UC患者有效率高达90%。虽然FMT在治疗UC上有着较好效果，但目前对FMT治疗UC的作用机制仍未完全明确。

由于目前多数学者已经对TLRs介导的信号转导途径中TLRs/NF-κB通路调节肠黏膜炎症因子的机制已经有较多研究，已证实TLR4、NF-κB的表达可上调或下调肠黏膜炎症因子，而UC又属于炎症性肠炎，炎症因子在UC的发生发展中起到重要作用[17-18]。因此本文通过粪菌移植治疗UC模型小鼠，探讨基于TLR4、NF-κB信号通路，FMT治疗UC的作用机制。本文采用DAI、HPS来体现不同UC小鼠的症状程度，结果发现，对照组由于未建立UC模型，相对于造模对照组和FMT干预组，DAI、HPS均较低;FMT干预组经过FMT干预，DAI、HPS明显降低，低于造模对照组;而造模对照组建立UC模型后，仅进行PBS缓冲液灌肠，并无治疗作用，因此DAI、HPS最高。结果提示对照组未发生UC，FMT干预组小鼠UC病情有所缓解，而造模对照组小鼠未得到治疗，UC病情严重。在对比三组小鼠结肠长度时发现，对照组最长，造模对照组最短，这是由于FMT干预组经过FMT治疗，结肠肠黏膜得到修复改善，而造模对照组未治疗，结肠肠黏膜损伤严重，长度明显缩短。本研究发现，造模对照组TLR4、NF-κB（p65）以及上述下游细胞因子表达水平最高，FMT干预组其次，对照组最低。结果显示，FMT干预组经过FMT干预能明显降低TLR4、NF-κB（p65）和各细胞因子表达水平。在Di等[19]研究结果显示，经过FMT干预的小鼠炎症因子水平明显低于未干预的小鼠，结果表明FMT能一定程度上抑制炎症因子的合成和释放，降低炎症反应。本文研究结果与其结果一致。通过最终对比TLR4、NF-κB（p65）和各因子表达水平与三组小鼠的症状时发现，随着小鼠UC程度越严重，TLR4、NF-κB（p65）和各因子表达水平越高，结果提示TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8表达水平与UC症状呈明显正相关。这表明TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8參与了UC的发生和发展，TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8表达水平提高，导致UC更严重。而经过FMT干预，能有效下调TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8的表达水平，这表明FMT是通过控制TLR4、NF-κB（p65）信号通路，来下调TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8的表达水平，从而减轻肠道炎症反应，缓解UC症状。

Tfh和Tfr是CD4+T淋巴细胞的新亚型，主要由淋巴滤泡细胞分化而成，对平衡机体免疫力具有重要作用。研究显示，自身免疫性疾病与Tfh/Tfr比例失衡具有重要关系[20]。在本文结果中发现，造模对照组Tfh和Tfh/Tfr均明显高于对照组和FMT干预组（P<0.05），表明两者可能参与了UC的发病过程。Tfh具有帮助B细胞发育的功效，能提高抗原亲和力，维持长期体液免疫应答。Tfr是从调节性T细胞分化而来，具有趋化受体CXCR5的作用，抑制B细胞的分化和成熟，生成抗体等。结果显示，造模对照组的Tfh和Tfr水平均高于对照组（P<0.05），且Tfh升高更明显，因此Tfh/Tfr明显升高。可见造模对照组发生了抗原抗体免疫反应，Tfh和Tfr均被刺激分化，以Tfh升高为主，进一步促进免疫应答。FMT干预组Tfh及Tfh/Tfr水平较造模对照组有明显降低（P<0.05），表明接受粪菌移植后，小鼠上述指标有明显下降，而Tfr水平升高，可见Tfh具有促进炎症因子的作用，而Tfr是UC的保护因子。

综上所述，粪菌移植可通过控制TLR4、NF-κB信号通路的表达，下调TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr表达水平，达到改善UC的临床症状。

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（收稿日期：2021-02-18） （本文編辑：田婧）