构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统

岳鹏鹏，黎成钦，农月娟，陈 玲，付 灿，于鸿浩

(桂林医学院 生物技术学院，广西 桂林 541199)

成簇规律间隔短回文重复序列/Cas蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)系统是目前广为使用的基因组编辑系统[1-3]，具有设计简单灵活、打靶高效以及低成本的特点[4]，极大地推动了农业和生物医学等领域的发展[5-6]，同时也为人类遗传病的深入研究提供了可靠的研究手段[7]。

单纯性大疱性表皮松懈症(epidermolysis bullos simplex,EBS)是一种常染色体显性遗传病[8]，也是一种严重的皮肤病。患者皮肤的真皮胶原纤维结构发生改变，皮肤、黏膜的脆性增加，轻微的机械摩擦或外伤可导致皮肤出现大疱性糜烂为特点的皮肤和黏膜机械应激反应[9]。目前该病的分子机制仍不清楚，治愈该病的方法也有待进一步探索[10]。研究表明人KRT14突变是该病主要病因之一。正常人的皮肤内KRT14编码蛋白在表皮基底层和毛囊中表达，是一种重要的结构蛋白——角蛋白(keratins)。KRT14的突变具有高度的遗传异质性，不同突变类型引起的临床症状、临床表现亦不相同。因此，有必要筛查明确的、典型的KRT14强致病突变位点，并将突变位点定位于小鼠基因组上，然后通过CRISPR/Cas9系统对该位点进行打靶，方可建立Krt14突变细胞模型或小鼠动物模型，从而精准的模拟单纯性大疱性表皮松懈症，对深入理解KRT14的致病机制以及探索可行的治疗策略具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9系统包括两种质粒，分别为单导RNA(single-guide RNA,sgRNA)表达质粒pGL3-sgRNA-PGK-puromycin(addgene #51133)和Cas9表达质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(addgene#44758);小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3(广州大学周建奎博士惠赠)，实验所需的其他试剂参考已发表的文章[11]。

1.2 方法

1.2.1 人KRT14致病位点的筛查：单纯性大疱性表皮松懈症是由KRT14突变引起的，首先利用OMIM数据库筛查人KRT14的致病突变；再利用ExAC在线数据库检索KRT14功能失活突变；同时利用ClinVar数据库检索KRT14致病突变情况。综合分析3个数据的结果，确定人KRT14典型的、明确的强致病变异位点。

1.2.2 sgRNA的设计与合成：本研究利用Clustal Omega在线软件比对人KRT14和小鼠KRT14蛋白序列，在蛋白水平将人典型的、明确的强致病变异位点定位于小鼠KRT14蛋白上，找到小鼠的KRT14拟突变位点。然后从Ensembl数据库中导出小鼠Krt14基因序列，利用Vector NTI软件定位拟突变位点的DNA编码序列，围绕小鼠的拟突变位点设计基因靶点。利用Vector NTI软件找到拟突变位点附近的特征序列作为本研究的靶点，Blast分析确定靶点在基因组内的唯一性。根据确定的打靶位点DNA序列合成sgRNA的互补寡核苷酸序列，合成时在互补双链的5′加上黏性末端序列，便于后续的sgRNA表达载体构建。

1.2.3 sgRNA表达载体的构建：sgRNA表达载体的构建步骤主要包括寡核苷酸的退火、pGL3-U6-sgRNA表达载体的酶切和回收、退火产物和酶切产物的连接等，详细参考已发表文章[11]最终成功构建了pGL3-U6-Krt14-sgRNA1、pGL3-U6-Krt14-sgRNA2、pGL3-U6-Krt14-sgRNA3和pGL3-U6-Krt14-sgRNA4等4个表达质粒。

1.2.4 细胞的培养、转染及药物筛选：将小鼠NIH3T3细胞培养于含5%胎牛血清的DMEM完全培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中增殖，每2 ～ 3 d更换新鲜培养基，待细胞汇合度达到80%～90%，以0.25%胰蛋白酶消化并传代接种至6孔板中，16～18 h后待细胞汇合度达到80%～90%时进行转染。

采用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(InvitrogenTM)试剂盒分别将pGL3-U6-KRT14-sgRNA1质粒、pGL3-U6-KRT14-sgRNA2质粒、pGL3-U6-KRT14-sgRNA3质粒、pGL3-U6-KRT14-sgRNA4质粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞。转染时，sgRNA表达质粒2.5 μg，Cas9表达质粒2.5 μg。

转染24 h后，用10 μg/mL的嘌呤霉素和20μg/mL的杀稻瘟菌素进行药物筛选48～72 h，分别得到阳性的sgRNA1-Cas9、sgRNA2-Cas9、sgRNA3-Cas9和sgRNA4-Cas9共转染细胞。然后，将上述4组共转染细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用0.25%的胰蛋白酶消化，并离心收集，待用。

1.2.5 打靶效率和基因型分析：打靶效率分析时，收集共转染的药筛阳性细胞，并采用PCR的方法扩增打靶位点区域的DNA，Sanger测序判断是否发生了基因编辑，详细参考发表的文章[11]。

基因型分析时，将PCR产物进行TA克隆，随机挑选菌落进行测序，然后使用Snapgene进行序列对比，找到靶点位置的变异序列，具体参考已发表文章[11]。

2 结果

2.1 人KRT14致病位点的筛查结果

OMIM数据库筛查结果表明单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)是由KRT14突变所引起，共筛查到17个突变位点(表1)；ExAC在线数据库检索到KRT14功能失活突变9种(表2)；ClinVar数据库共检索到36种突变(表3)。OMIM与ExAC数据库的结果吻合度不高，鉴于ExAC数据库仅提供了变异情况并未给出表型和致病性的数据，本文以OMIM检索结果为主要判定依据。KRT14p.Arg125致病位点同时在OMIM和ClinVar数据库中收录，说明该位点为较为明确的致病位点。

表1 OMIM数据库中人KRT14致病突变情况Table 1 Pathogenic mutations of human KRT14 in OMIM database

表2 ExAC数据库中人KRT14功能失活突变情况Table 2 Mutation of human KRT14 function inactivation in ExAC database

表3 ClinVar数据库中人KRT14缺失突变情况Table 3 Human KRT14 deletion mutation in ClinVar database

2.2 sgRNA表达载体的构建与鉴定

由于人和小鼠的物种差异，同一功能基因的基因结构可能并不相同。本文比对了人KRT14和小鼠KRT14蛋白序列，发现人KRT14 p.Arg125位点与小鼠KRT14 p.Arg131位点相对应(图1)。然后从Ensembl数据库中导出小鼠Krt14基因序列，利用Vector NTI软件定位p.Arg125位点的DNA编码序列，然后在其附近设计了4个打靶位点，分别为Krt-M-sgRNA1、Krt-M-sgRNA2、Krt-M-sgRNA3和Krt-M-sgRNA4(图2)。

The black line indicated that the human KRT14 p.Arg125 site corresponds to the mouse KRT14 p.Arg131 site图1 人KRT14蛋白与小鼠KRT14蛋白序列比对结果Fig 1 Alignment results of human KRT14 protein and mouse KRT14 protein sequence

图2 小鼠Krt14靶点及sgRNA序列Fig 2 Mouse Krt14 targets and sgRNA sequences

上述4个sgRNA单导向序列的5′端加上“accg”合成得到正向寡核苷酸序列(表4)；在DNA互补链的5′端加上“aaac”合成得到反向寡核苷酸序列(表4)经退火、连接转化、质粒提取以及测序鉴定等成功构建了4种sgRNA表达质粒(图3)。测序引物为U6通用引物。

表4 化学合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸Table 4 Chemically synthesized forward and reverse oligonucleotides

The blue background represented the inserted sgRNA sequence;A.pGL3-U6-KRT14-sgRNA1 plasmid sequencing diagram;B.pGL3-U6-KRT14-sgRNA2 plasmid sequencing diagram;C.pGL3-U6-KRT14-sgRNA3 plasmid sequencing diagram;D.pGL3-U6-KRT14-sgRNA4 plasmid sequencing diagram图3 sgRNA表达质粒测序峰图Fig 3 sgRNA expression plasmid sequencing peak map

2.3 打靶效率的分析结果

以药筛阳性细胞裂解液为模板进行PCR扩增，扩增产物包含打靶位点区域，引物序列见(表5)。Sanger测序发现4个靶点位置均有套峰出现，说明靶点位置呈现不同的DNA序列，表明打靶成功(图4)，其中KRT14-M-sgRNA4的打靶位点序列在测序结果中已完全检索不到，表明突变效率很高。

图4 打靶位点PCR产物测序峰图Fig 4 Peaking sequence of PCR products including the target site

表5 打靶位点PCR扩增引物Table 5 PCR primers for amplification of the target site

2.4 基因分型的结果

将上述打靶成功的PCR产物进行胶回收，并克隆至pMD19载体中，利用通用测序引物M13F进行测序，根据测序结果进行基因分型分析。每个位点随机送测20个菌落克隆(图5)，测序结果与原序列比对分析表明，在Krt-M-sgRNA1、Krt-M-sgRNA2、Krt-M-sgRNA3和Krt-M-sgRNA4靶点位置发生了碱基的随机插入和缺失，编辑效率分别为70%、90%、65%和100%(图6)。

3 讨论

通常基因敲除的研究中在设计打靶位点时主要遵循的原则包括选择前1/2外显子作为设计区域[12]、涉及多个转录本的基因时选择保守的外显子区域来设计靶点、选择低脱靶效应的位点作为靶点等。其目的是基于CRISPR/Cas9系统在靶点位置形成移码突变，使基因功能失活，进一步研究基因功能等[13]。本研究的主要目的是通过编辑小鼠Krt14模拟人类KRT14基因的致病变异，为后续建立Krt14基因工程小鼠奠定基础，可见本文的研究目的与一般的基因敲除研究基因功能略有不同。因此本文通过多个数据库的检索筛查人KRT14基因的变异及致病情况，试图找到明确的、典型的强致病位点。3个数据库KRT14基因变异情况的比对结果显示KRT14 p.Arg125位点被OMIM和ClinVar两个数据库同时收录，并明确为致病位点。此外，该位点也位于整个蛋白序列的前1/2，符合基因打靶的一般规则。明确拟突变位点后，本研究进一步通过蛋白序列比对，将该位点定位于小鼠KRT14蛋白中，再根据其编码DNA序列和CRISPR/Cas9系统对序列结构的要求设计了4个sgRNA序列。

为了验证设计的sgRNA打靶效率，本文构建了sgRNA表达载体，并与Cas9表达载体共转染小鼠3T3细胞。转染效率以及sgRNA和Cas9在细胞中的表达量是影响最终编辑效力的关键因素。为提高转染效率，本研究选择LipofectamineTM3000 Transfection Reagent进行转染，效果良好。此外，也使用高剂量的药物进行筛选，以杀伤阴性转染细胞以及sgRNA和Cas9低表达的阳性细胞，从而提高打靶效率。4个位点的打靶效率分别为70%、90%、65%和100%，均超过50%，表明打靶效率较高。

M.DL2000 plus DNA marker;the number represented the colony number图5 菌液PCR验证阳性克隆电泳图Fig 5 Electrophoresis of positive clones verified by bacterial PCR

Bold fonts were target sequences and italics were PAM structures;lowercase letters represented insertion sequences;“-” represented deletion bases;“+N” and “-N” represented insertion and deletion base numbers;“N/N”represented the number of genotypes and the total number of clones sent for testing图6 4个靶点的基因型Fig 6 Genotypes of the 4 targets

小鼠NIH 3T3细胞是普遍使用的细胞系，培养条件简单、易操作，且目标打靶序列与C57/B6J遗传背景小鼠的序列一致，因此本文选择在NIH 3T3细胞上评估建立的靶向Krt14基因CRISPR/Cas9系统的打靶效率，为后续通过受精卵注射构建Krt14基因敲除小鼠模型提供理论支撑。虽然NIH 3T3细胞具有其优点，但是耐药性不稳定，与其细胞状态和培养条件密切相关，造成药物筛选浓度的不确定性。本研究采用的高剂量药物筛选的策略以得到阳性转染细胞，并使用TransDirect®Animal Tissue PCR kit试剂盒裂解细胞，释放基因组DNA，用于打靶效率检测，效果良好。