一例儿童醛固酮和皮质醇共分泌肾上腺瘤的临床表现及全外显子测序分析

王慧萍，文 进，崔云英，马晓森，任卫东，童安莉*

(1.河北北方学院 研究生院,河北 张家口 075000；中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 2.内分泌科国家卫生健康委员会内分泌重点实验室；3.泌尿外科，北京 100730)

原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，简称原醛)在继发性高血压中十分常见，国外报道在1、2、3 级高血压患者中原醛患病率分别为1.99%、8.02% 和 13.2%[1]，在难治性高血压中为17%～23%[2]。原醛亚型主要为分泌醛固酮的腺瘤(aldosterone-producing adenoma)和特发性醛固酮增多症[3]，家族性醛固酮增多症等类别较少见。腺瘤约占原醛的35%。家族性醛固酮增多症<1%，儿童患者常见于家族性原醛，罕见发生醛固酮瘤，迄今文献报道儿童醛固酮瘤仅20余例，其临床及基础研究极少，发生机制尚不清。同时合并皮质醇分泌的儿童醛固酮瘤尚未见报道。本研究拟对一例罕见的儿童醛固酮和皮质醇共分泌肾上腺皮质腺瘤患者的临床特点进行分析，并进行全外显子测序，筛选与其发病相关的突变基因。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为一例在北京协和医院诊断并接受手术的儿童醛固酮和皮质醇共分泌肾上腺皮质腺瘤患者。对患者的临床资料进行回顾性分析。收集患者的外周血及手术切除的肿瘤组织，提取DNA，进行全外显子测序及生物信息学分析。用患者肿瘤组织的石蜡切片进行醛固酮合成酶CYP11B2的免疫组织化学染色。本研究获得北京协和医院伦理委员会审查批准(伦理审批编号：S-K431)和患者监护人的知情同意。

1.2 外周血及肿瘤组织全外显子测序及生物信息学分析

收集患者外周血和冰冻的肿瘤组织，根据试剂盒(Qiagen公司)操作说明提取外周血和肿瘤组织DNA，送明码生物科技有限公司行全外显子测序。测序深度>200×,Q30≥80%。

生物信息学分析：取患者外周血DNA全外显子测序结果以及对肿瘤-外周血成对样本过滤筛选组织中体细胞变异：1)保留千人基因组数据库中突变频率<0.1%的位点；2)保留位于外显子区或剪切位点的变异；3)去掉同义突变；4)保留ClinVar数据库或ACMG注释为”Pathogenic”或“Likely pathogenic”的位点；5)保留已报道与肾上腺疾病相关的致病基因突变位点。

1.3 CYP11B2免疫组织化学染色

用EnVision法(Dako公司)进行CYP11B2的免疫组织化学染色，一抗为小鼠抗CYP11B2单克隆抗体(稀释倍数为1∶200，美国密西西比大学医学院Celso E.Gomez-Sanchez教授惠赠)。

2 结果

2.1 病史

患者为13岁男性。2019年8月发现持续性血压升高，无明显头晕、头痛，最高血压190/140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),同时发现低血钾，最低血钾1.2 mmol/L,在当地医院行F-脱氧葡萄糖PET/CT(fluorodeoxyglucose PET/CT,18F-FDG-PET/CT)提示右肾上腺4.5 cm ×3.6 cm占位，SUVmax 4.0。予酚苄明、螺内酯和补钾治疗，患者血压控制在140/100 mmHg,血钾 3.7 mmol/L。2019年9月到北京协和医院就诊。病程中患者无多饮多尿及夜尿增多，大便每日1次，身高1年内无明显增加，体质量增加3 kg，无喉结长出，无勃起。否认棉籽油、甘草类、中药和利尿剂等服用史。既往体健；个人史无殊，家族史：爷爷和外公患高血压。

体格检查：身高155 cm，体质量48 kg，BMI 20.0 kg/m2；BP 135/93 mmHg，发育良好，体型正常，无满月脸、水牛背及向心性肥胖，无皮肤紫纹，皮肤不薄。唇上可见小须，HR 79次/min，心律齐，未闻及病理性杂音，双肺清，腹软，肝脾未及肿大，双下肢无水肿。

辅助检查：血尿常规、肝肾功能均正常，血钾3.7 mmol/L,血钠144 mmol/L,24 h尿钾133.4 mmol,血气分析：pH 7.44,HCO3-27.9 mmol/L,SBE 4.0 mmol/L，立位醛固酮 40.92 ng/dL，立位肾素活性 0.01 ng/mL/h，醛固酮和肾素活性比值明显升高，开搏通试验提示升高的醛固酮不被抑制；24 h尿游离皮质醇轻度升高，小剂量过夜地塞米松抑制试验不被抑制，其他肾上腺功能检查均正常(表1)。

表1 患者的实验室检查Table 1 Laboratory examination of the patient

质谱分析(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)质谱法检测肾上腺皮质激素，结果显示醛固酮及其前体孕稀醇酮、孕酮和去氧皮质酮明显增加，皮质醇合成前体17羟孕稀醇酮也升高(图1)。腹盆增强CT提示右肾上腺4.5 cm ×3.6 cm占位，边界清晰，增强扫描可见明显强化，强化略不均匀，箭头所指(图2A，B)，生长抑素受体显像和肾上腺髓质显像右肾上腺占位未见异常摄取。

图1 LC-MS质谱法检测肾上腺皮质激素结果Fig 1 Results of adrenocortical hormones detected by LC-MS(ng/mL)

结合临床和激素测定，患者的诊断考虑为原醛合并亚临床库欣综合征，右肾上腺腺瘤可能性大。行腹腔镜下右肾上腺占位切除术，病理：(右肾上腺)灰褐结节一枚，重40.2 g，大小4.5 cm×3.7 cm×3.5 cm，切面灰褐灰黄、实性、质中(图2C，D)。镜下病理提示肾上腺皮质腺瘤，免疫组化染色：melan-A(弱+)，Ki-67指数(1%)，vimentin(+)，α-inhibin(+)，CYP11B2(+)(图3)。术后患者停用降压药，血压完全正常，110/70 mmHg，复查血钾4.6 mmol/L。术后2月复查醛固酮水平恢复正常(表1)。

2.2 外周血和肿瘤组织DNA的全外显子测序

在患者的外周血DNA全外显子测序结果中没有发现已报道的遗传性肾上腺疾病相关的基因突变。用患者的肿瘤-外周血成对样本过滤筛选组织中体细胞突变，结果发现组织中存在CTNNB1 c.133T>C(p.S45P)位点突变(图4)，没有检测出常见的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D等基因突变。

3 讨论

原醛的主要类型为醛固酮瘤和特发性醛固酮增多症[3]。醛固酮瘤为腺瘤分泌过量醛固酮，导致潴钠排钾,血容量增多,肾素-血管紧张素系统活性受抑制，患者主要表现为高血压，伴或不伴低血钾。本例醛固酮瘤患者有典型的高血压和低血钾的表现，但临床上有其特殊性：患者起病年龄早，肿瘤体积较大，同时合并皮质醇分泌。

最近一项中国的纳入100例醛固酮瘤患者的研究显示，患者平均诊断年龄为(49.3±11.8)岁[4]；本文总结144例醛固酮瘤患者，平均诊断年龄45(21～71)岁。儿童起病的醛固酮瘤非常罕见，均为个案报道，迄今国际上共报道20余例[5]。醛固酮瘤中脂质成分较多、缺乏血供，肿瘤生长缓慢，体积常较小，平均直径为1.5 cm[6-7]，本文总结的144例患者中醛固酮瘤平均直径1.7(0.7～3.5)cm，本例肿瘤最大径4.5 cm，较常见醛固酮瘤大。

醛固酮和皮质醇共分泌腺瘤(aldosterone-and cortisol-coproducing adrenal adenoma)在1979年首次被报道，在一项中国的回顾性分析199例肾上腺皮质肿瘤患者的研究中，9例(4.5%)为醛固酮和皮质醇共分泌腺瘤[8]。

最新的研究表明，共分泌瘤在原醛中的发生率为4%～16%[9-10]。在一项对4例共分泌瘤的研究中，患者年龄较大(70～85岁)，瘤体较大(直径分别为1.9、3.3、8.3、12 cm)[11]；在另一项研究中，共分泌瘤患者的平均年龄52岁 (34～80岁)，超过2/3的患者为女性[12]。有文献报道了这种共分泌瘤通常比单纯分泌醛固酮的腺瘤大[13]。醛固酮瘤可表达皮质醇合成酶，在一定程度上分泌皮质醇，但临床高皮质醇血症只在大肿瘤中表现出来[14]。临床上患者若存在:1)醛固酮瘤>2.5 cm；2)过夜小剂量地塞米松抑制试验不被抑制；3)血清18-羟皮质醇水平明显升高，则考虑存在醛固酮和皮质醇共分泌瘤[12]。本例患者免疫组化显示醛固酮合成酶CYP11B2表达阳性，临床症状及生化检查提示原醛为主，皮质醇分泌轻度增多，因此，患者的皮质醇分泌增多与醛固酮瘤体积较大有关。

由于本例为儿童患者，对其进行了全外显子测序，但未发现已知的遗传性肾上腺疾病特别是家族性原醛的致病基因突变，同时患者无原醛的家族史，因此推断该患者为散发性合并皮质醇分泌的醛固酮瘤。

近几年的研究发现，醛固酮瘤与KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CLCN2、CACNA1H等基因的突变有关[3]，这些突变引起细胞内钙升高，使得醛固酮分泌增加[15]。此外，原醛腺瘤中还报道存在CTNNB1及PRKACA基因突变，此两基因突变后细胞增殖增加，促进肿瘤生长。一项对3例醛固酮和皮质醇共分泌腺瘤的研究中，2例腺瘤存在KCNJ5突变，分别为c.451G>A(p.G151R)和c.503T>G(p.L168R)突变。报导的3例腺瘤中CYP11B1、CYP11B2、HSD3B2、CYP17A1、CYP11A1等类固醇激素合成酶的mRNA水平与8例未表现出上述皮质醇自主分泌的单纯醛固酮瘤无明显差异[16]。儿童醛固酮瘤罕见，发病机制的探讨仅见于一篇文献，该病例为11岁日本女孩，KCNJ5基因p.L168R突变是其腺瘤分泌醛固酮增多的原因[5]。本例用肿瘤-外周血成对样本过滤筛选组织中变异发现患者腺瘤中存在CTNNB1突变。有文献已报道在醛固酮瘤中CTNNB1突变率为2%～5%[17]。另外，CTNNB1突变也在皮质醇瘤、无功能瘤和腺癌等中发现。CTNNB1突变促进肿瘤生长，这也解释了本例患者肿瘤体积大的原因。

综上所述：儿童醛固酮和皮质醇共分泌腺瘤十分罕见，其发病机制不甚清楚，本例用肿瘤-外周血成对样本过滤筛选组织中变异发现CTNNB1突变，解释了此例腺瘤的可能发生机制，由于这类疾病的儿童病例罕见，其临床特征和病因的阐明尚需积累病例并进行进一步的研究。