皮肤微针辅助治疗斑秃的疗效与临床评估

彭雅雯，雷铁池

(武汉大学人民医院 皮肤科，湖北 武汉 430060)

斑秃(alopecia areata，AA)是一种常见的自身免疫性脱发。易发于青壮年，影响美观，使患者产生自卑、焦虑和抑郁等情绪，AA的患病率约为2%[1]。毛囊是一个免疫赦免器官，正常状态下，毛囊角质形成细胞下调主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)I类分子的表达，同时毛囊周围产生大量免疫抑制因子如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)等，使毛囊免遭自身免疫系统的攻击[2]。一旦毛囊免疫赦免崩溃(immune privilege collapse)，生长期毛囊遭受CD8+T细胞的攻击快速进入退行期，导致AA病理发生[3]。目前临床有效的斑秃治疗主要包括局部或系统使用糖皮质激素、二苯环丙烯酮(diphenylcycloproterenone，DPCP)介导的局部免疫治疗，以及外用促毛发生长剂米诺地尔等。然而，这些治疗方法的有效性难以令人满意，甚至一旦治疗中断常导致斑秃复发。利用微针联合曲安奈德成功治疗难治性斑秃3例，新生发均大于50%，且无明显的不良反应[4]，但该研究样本量较小，未能充分证明微针治疗斑秃的有效性。皮肤微针(micro-needl-ing)是近年来在临床出现的一种安全、有效和微创的治疗技术，微针损伤皮肤后即刻发生炎性反应，血小板源性的生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等释放增加，有可能激活毛囊隆突区干细胞，促进毛发生长[5]。本研究观察了1.5 mm皮肤微针辅助治疗AA的临床疗效以及探讨了0.5 mm皮肤微针针刺小鼠背部皮肤对毛囊生长及毛囊上皮干细胞标志物表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 临床观察

1.1.1 病例选择：52例(男25例，女27例)AA招募自2018年3月至2019年8月武汉大学人民医院皮肤科。纳入标准：1)年龄18～60岁；2)符合斑秃诊断标准；3)病程大于3月，稳定或进行性脱发；4)近一个月未使用促进头发生长的药物。排除标准：1)全秃、普秃；2)其他原因导致的脱发；3)凝血功能异常；4)毛发移植史；5)脱发区患有其他皮肤病(如鲜红斑痣、毛囊炎、皮肤感染等)。此研究经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准，患者入组前均签署知情同意书。

1.1.2 治疗方法：微针组：脱发区外涂复方利多卡因乳膏封包1 h，局部麻醉后碘伏消毒，用1.5 mm微针(广州领美美容美体器材有限公司)沿水平、对角线方向各滚刺4～5次，力度以皮肤出现点状出血为易。针刺皮肤24 h后，每日1次局部外用5%米诺地尔酊(minoxidil tincture)(浙江万晟药业有限公司)和0.05%卤米松乳膏(香港澳美制药有限公司)；对照组仅予以5%米诺地尔(minoxidil)药物治疗。每3周随访1次，拍照记录毛发生长情况，进行斑秃严重程度评分(severity of alopecia tool，SALT)。

1.1.3 疗效判断：根据SALT[6]评估病情。SALT为0分代表没有头发脱落，100分代表整个头皮头发脱落，头发再生百分率=(SALT治疗前-SALT治疗后)/SALT治疗前×100%。新生发大于50%为有效，大于75%为治愈，总有效率=有效率+治愈率。

1.2 动物实验

1.2.1 主要材料、试剂：SPF级C57BL/6小鼠，18只，雌性，体质量16～18 g[湖北省疾病预防与控制中心，许可证号：SYXK(鄂)2015-0018]。米诺地尔(武汉银河化学原料有限公司);抗鼠K15单克隆抗体(Thermo Fisher Scientific公司);0.5 mm微针(广州领美美容美体器材有限公司)。

1.2.2 小鼠的分组及处理：1)小鼠采用戊巴比妥钠腹腔麻醉，松香石蜡混合加热融化后涂抹于小鼠背部脱毛，范围约4 cm × 3 cm，建立脱发模型[7]。将脱毛后小鼠随机分为3组：模型组、米诺地尔组、微针组，每组6只。2) 脱毛后第2天开始，米诺地尔组：局部外涂100 μL 2%米诺地尔溶液；微针组：0.5 mm微针在小鼠背部脱毛区沿水平、对角线方向各滚刺4～5次，2组治疗均隔日1次；模型组不予以处理。

1.2.3 观察并记录结果：隔日拍照记录小鼠背部皮肤颜色变化、毛发生长情况，第14天拔取小鼠背部新生毛发5～10根，测量长度。

1.2.4 HE染色：第14天经麻醉处死小鼠后，取背部皮肤甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，正置显微镜拍照，观察毛囊形态，在显微镜下(100×)计数每个视野毛囊数目。

1.2.5 免疫组化：将以上制备的石蜡切片进行鼠单克隆抗体K15免疫组化染色，镜检拍照，用Image J软件计数单根毛囊的K15染色阳性细胞数目。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 临床观察

治疗12周后，微针组患者治愈率为59.3%，总有效率为74.1%，对照组治愈率24.0%，总有效率56.0%。微针组疗效优于对照组，Z=2.218，P=0.042(图1，表1)。疼痛为微针组的主要不良反应，但大多数患者在微针治疗后数小时疼痛可缓解，且局部利多卡因乳膏封包后，疼痛可耐受。另外有3位患者开始治疗时，脱发区皮肤出现红斑、鳞屑、瘙痒，考虑与药物(米诺地尔)过敏有关，1周后缓解，未出现其他明显不良反应。

表1 微针组与对照组临床疗效比较Table 1 Comparison of clinical efficacy between micro-needling group and control group(n,%)

图1 微针治疗后毛发生长变化Fig 1 Hair growth after micro-needling treatment

2.2 动物实验

小鼠脱毛0 d，皮肤呈现粉红色，微针组小鼠脱毛区皮肤平均在脱毛(6.08±0.74)d后皮肤完全变黑，模型组平均(7.33±0.61)d，微针组小鼠背部皮肤较模型组约提前1.25 d完全变黑(P<0.05)(图2，表2)。第14 d，微针组小鼠背部新生毛发长度较模型组长，P<0.05(表2)。HE染色显示模型组多见休止期毛囊，微针组毛囊体积较大且长，主要为生长期毛囊，微针组毛囊数量也较模型组增多(图3，表2)。免疫组化染色显示微针组毛囊K15阳性细胞数目较对照组增多，K15阳性细胞主要位于毛囊隆突区和外毛根鞘细胞(图4，表2)。

表2 不同处理组小鼠毛发长度、每视野毛囊数目、背部皮肤变黑时间以及毛囊K15+细胞数目比较Table 2 Comparison of the skin darkening time,the hair length,the number of hair follicles and the K15+ cells in each n=6)

图2 小鼠背部皮肤颜色变化Fig 2 Comparison of skin color of the mice

图3 小鼠背部皮肤组织HE染色观察Fig 3 HE staining results of skin tissue

图4 免疫组化检测小鼠毛囊K15表达Fig 4 Expression of K15 in hair follicle was detected by immunohistochemistry

3 讨论

毛囊免疫赦免破坏是AA病理发生的主要原因，但AA自身反应T细胞活化的关键免疫途径尚不明确，这也就限制了AA靶向治疗的临床发展。恢复毛囊免疫赦免、诱导毛发进入生长期是AA治疗的关键[8]。米诺地尔、糖皮质激素是传统的AA治疗药物，米诺地尔通过刺激毛囊真皮乳头细胞，促使毛囊进入生长期[9]，糖皮质激素具有抗炎(抗感染)和免疫抑制的作用，阻止自身免疫反应对毛囊的攻击[8]。本研究将近年来广泛应用美容及医学领域的皮肤微针与传统药物联合治疗AA，并与单纯药物治疗进行对照。结果显示，微针组总有效率和痊愈率显著优于对照组，有助于提高斑秃疗效。

为了进一步探明微针对毛囊生长的影响，本研究选用0.5 mm微针针刺小鼠背部皮肤，观察小鼠背部皮肤颜色变化、新生毛发长度、毛囊形态、数目及毛囊干细胞标记蛋白K15的表达。小鼠背部皮肤中的黑素仅来源于生长期毛囊黑素细胞，小鼠背部皮肤休止期为粉红色，退行期为灰色，生长期为黑色，由此可大致根据皮肤颜色来判断毛囊是否进入生长期[10]。本实验中，微针组小鼠皮肤变黑时间较模型组缩短，新生毛发长度较模型组长，提示微针组小鼠毛囊提前进入生长期，毛发生长速度快。毛囊上皮干细胞主要位于毛囊隆突区，具有分化形成毛囊的所有细胞谱系的能力，与周期性的毛囊生长变化有着密切联系。静止期毛囊干细胞接受真皮乳头信号刺激后被激活、增殖，下一个毛囊生长期开始启动。免疫组化染色显示微针组毛囊K15阳性细胞数目较模型组增多，提示微针针刺可刺激毛囊上皮干细胞增殖，从而诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长。

综上所述，皮肤微针辅助传统的AA治疗药物米诺地尔、糖皮质激素有助于提高AA疗效，其机制可能是刺激毛囊上皮干细胞，诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长。