微生物降解孔雀石绿的研究进展

田小丽，李绪鹏，李春生，陈胜军*，薛勇，邓建朝，潘创，王悦齐

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300;2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；3.广东省农业技术推广中心，广东 广州 510520)

孔雀石绿(malachite green,MG)是一种人工合成的三苯甲烷类化合物，其对鱼类的水霉病、原虫病等具有良好的控制效果，曾在水产养殖业中作为杀菌剂和杀虫剂被广泛使用[1]。研究表明，孔雀石绿被鱼体吸收后会迅速转化为稳定性和毒性更高的隐性孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)，容易在生物体组织中蓄积，对自然环境和人类健康造成严重危害[2]。因此，中国于2002年将孔雀石绿列入水产养殖业的禁用药物，但违规使用情况仍时有发生。

由于养殖水体或环境中存在孔雀石绿残留的情况，因此有效降解孔雀石绿已成为目前水产养殖行业亟待解决的问题。与传统的物理化学法相比，微生物法具有操作简单、价格便宜、降解效率高等优点，应用前景更为广阔[3]。本研究综述了利用微生物降解孔雀石绿的国内外研究进展，总结了微生物降解孔雀石绿的主要研究方法，明确了降解孔雀石绿的微生物分类，分析了影响微生物降解孔雀石绿的主要因素和主要作用酶类，结合降解产物推测了微生物可能的降解路径，从而为微生物降解孔雀石绿的研究与应用提供参考。

1 微生物降解孔雀石绿的主要研究方法

根据检测仪器和方法的不同，微生物降解孔雀石绿的研究方法主要分为孔雀石绿脱色评价法和孔雀石绿降解评价法。

1.1 孔雀石绿脱色评价法

孔雀石绿脱色评价法主要为紫外可见-分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis)，通过测量微生物降解前后孔雀石绿特征吸收峰(波长通常为620 nm)吸光度的变化，计算孔雀石绿脱色率，来评价微生物对孔雀石绿的脱色效果[4]。紫外可见-分光光度法具有仪器简便、操作简单、快速等优点。然而，该方法重点关注孔雀石绿的减少，无法评价这种脱色作用是由孔雀石绿还原为隐性孔雀石绿引起的，还是由孔雀石绿被继续分解为小分子物质引起的。

1.2 孔雀石绿降解评价法

孔雀石绿降解评价法，以色谱分离为主，通过紫外、荧光或质谱检测器进一步分析孔雀石绿降解效果，计算孔雀石绿降解率，主要包括高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、硼氢化钾还原-高效液相色谱荧光检测法(KBH4reduction-high performance liquid chromatography with fluorescence detector，KBH4-HPLC-FLD)、高效液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等[5]。这些方法灵敏度高，不仅可以分析孔雀石绿是否被降解为隐性孔雀石绿，还可以通过质谱分析进一步解析孔雀石绿可能存在的其他降解产物。

2 降解孔雀石绿的微生物分类

2.1 细菌

细菌是降解孔雀石绿最常用的微生物。如表1所示，降解孔雀石绿的细菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)[6-7]、葡萄球菌属(staphylococcus)[8]、苍白杆菌属(Ochrobactrum)[9]、芽孢杆菌属(Bacillus)[10]、微小杆菌属(Exiguobacterium)[11]、无色杆菌属(Achromobacter)[12]、微球菌属(Micrococcus)[13]、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)[14]、肠杆菌属(Enterobacter)[15]、克雷伯氏菌属(Klebsiella)[16-17]等。其中，假单胞菌属、柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属，不仅具有很强的孔雀石绿脱色能力，而且具有进一步降解隐性孔雀石绿的能力。同时，某些细菌对孔雀石绿降解环境的营养需求较小，在不含有机物的基础盐培养基中就能降解孔雀石绿，甚至在水溶液中也能发挥孔雀石绿降解作用。Li等[17]筛选出一株能够在水溶液中降解孔雀石绿的菌株Klebsiellapneumoniae，该菌株对浓度为 1～20 mg/L的孔雀石绿在0.5 h内即可降解94.00%以上，对浓度为1～10 mg/L的孔雀石绿在12 h内即可完全降解。综合上述研究结果表明，细菌可能是未来降解孔雀石绿的主力菌。

表1 降解孔雀石绿的细菌Tab.1 Bacteria using for malachite green degradation

续表1，Tab.1 Continued

2.2 丝状真菌

真菌具有丝状生长趋势，可通过其菌丝网络及低底物特异性分解代谢酶进行营养转移[18]。白腐真菌是降解孔雀石绿最有效的丝状真菌。白腐真菌在自然界中分布广泛，主要包括栓菌属(Trametes)[19]、木耳属(Auricularia)[20]、侧耳属(Pleurotus)[21]、白耙齿属(Irpex)[22]等，对孔雀石绿具有广谱的底物多样性、高效、低耗、适用性强等独特的降解优势[23]。如表2所示，王倩等[24]研究发现40 ℃下Trametessanguinea对孔雀石绿的脱色率为91.24%。韩启灿等[25]从大型野生真菌中筛选到一株孔雀石绿高效降解菌，1 h内的孔雀石绿脱色率可达92.60%。另外，降解孔雀石绿的丝状真菌还包括曲霉菌属(Aspergillus)[26]、青霉菌属(Penicillium)[27]、木霉菌属(Trichoderma)[28]、漆斑菌属(Myrothecium)[29]等。如Jasińska等[30]分离出两株孔雀石绿降解菌，96 h内对10 mg/L孔雀石绿的脱色率分别为87.10%和97.40%。因此，真菌比细菌更适合用于孔雀石绿的降解，特别是丝状真菌。

表2 降解孔雀石绿的丝状真菌Tab.2 Filamentous fungi using for malachite green degradation

续表2，Tab.2 Continued

2.3 酵母菌

酵母菌降解孔雀石绿具有生长速度快、降解速度快、在不利环境中生存能力强等优点。但研究发现，相较于细菌、丝状真菌而言，降解孔雀石绿的酵母菌种类比较少，目前以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为主。相较于如表3所示，Peter等[31]从纺织废水中分离出一株Saccharomycescerevisiae，5 mg/L孔雀石绿在72 h内的脱色率为95.40%。Biradar等[32]发现Saccharomycescerevisiae在漆酶、孔雀石绿还原酶等各种酶的作用下基本可以脱除孔雀石绿。大多已报道的酿酒酵母具有较强的孔雀石绿脱色效果，但是降解率较低。

表3 降解孔雀石绿的酵母菌Tab.3 Yeasts using for malachite green degradation

3 影响微生物降解孔雀石绿的因素

微生物对生长环境很敏感，盐度、pH、温度等环境因素均能影响微生物的生长，从而影响孔雀石绿的降解。Jadhav等[33]研究发现Saccharomycescerevisiae对孔雀石绿的脱色效果有所差异，对100 mg/L孔雀石绿在水溶液中7 h的脱色率为85.00%，在含5%葡萄糖的培养基中4 h的脱色率为95.50%。研究发现，微生物降解孔雀石绿的效果取决于孔雀石绿浓度以及外界的环境因素，例如碳源、氮源、温度、pH、盐度、金属离子等[33-35]，通过研究各种因素对孔雀石绿降解作用的影响，明确微生物降解孔雀石绿的最适条件。

3.1 孔雀石绿初始浓度

一般情况下，随着孔雀石绿浓度的升高，孔雀石绿对微生物的毒害作用越大，降解率越低[34]。过高浓度的孔雀石绿甚至会完全抑制菌株对孔雀石绿的降解。刘单单等[35]研究了Enterobactersp.对1～40 mg/L孔雀石绿的降解情况，孔雀石绿浓度为1 mg/L时，降解率为92.20%，随着孔雀石绿浓度增加到40 mg/L时，降解率为82.40%。刘菁华等[36]从水产养殖池塘中筛选到的Citrobactersp.对2 mg/L孔雀石绿的降解率为96.32%，对5 mg/L孔雀石绿的降解率为85.80%，同一条件下，当孔雀石绿浓度为30 mg/L时，降解率仅为25.70%，此时菌株的生长明显受到抑制。梅嬛等[37]在盐培养基中加入孔雀石绿，Raoultellasp.对5 mg/L孔雀石绿的降解率为85.00%，而对浓度超过20 mg/L孔雀石绿的降解率不到50.00%，这与吴永利等[38]研究的Pseudomonassp.的孔雀石绿降解结果相似。

3.2 碳源

碳源是微生物生长的重要营养元素，不同碳源对孔雀石绿的降解影响较大，对不同微生物的孔雀石绿降解效果影响也不同。Schizophyllumcommune在不加碳源时的孔雀石绿脱色率为77.78%，添加麦芽糖时，脱色率增加至95.56%，而添加蔗糖时脱色率下降到66.89%，结果表明，添加蔗糖对Schizophyllumcommune脱色孔雀石绿有抑制作用，而添加麦芽糖能促进孔雀石绿的脱色[39]。葡萄糖作为自然界中分布最广的单糖,是促进微生物生长的良好碳源，在培养基中加入葡萄糖时，Burkholderiacepacia对孔雀石绿的脱色率从47.80%提高到了97.10%[40]。Angamuthu等[41]在盐培养基中加入1.00%葡萄糖时，孔雀石绿脱色率增加至99.06%。

3.3 氮源

氮源是微生物生长的基本营养元素，环境中不同的氮源对孔雀石绿的降解影响较大。研究表明，Burkholderiacepacia在缺乏氮源时的孔雀石绿脱色率仅为33.90%，而添加KNO3为氮源时孔雀石绿脱色率达到98.80%[40]。Angamuthu等[41]发现在盐培养基中加入酵母提取物作为氮源，Streptomyceschrestomyceticus的孔雀石绿脱色率从59.65% 增加至95.96%。Trichaptumlaricinu分别以麸皮、蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸铵作为不同氮源时，孔雀石绿脱色率均低于94.50%，与不加氮源的基础培养基相比有所下降，原因可能是氮源充足，菌体生长过于旺盛，不利于菌体脱色活性物质的积累[25]。

3.4 温度

适宜的温度不仅有利于菌株的快速生长，而且还有利于孔雀石绿的降解。细菌对孔雀石绿的最适降解温度一般在30～37 ℃，基本与其最适的生长温度一致。Citrobactersp.在15～20 ℃的低温条件下对孔雀石绿的降解率较低，在35 ℃时对孔雀石绿具有最高的降解率，达到67.50%[36]。Pseudomonasveronii在 30 ℃时孔雀石绿降解率最高，为92.30%，当温度较高(45 ℃)或较低(15 ℃)时降解率都比较低，分别只有42.20%和50.20%[6]。对于丝状真菌来说，最适的降解温度相对较低。随着温度升高Auriculariacornea的孔雀石绿降解率逐渐增大，并在26 ℃时达到最高，当温度升高到30 ℃时孔雀石绿降解率逐渐下降，这可能是因为该温度下不利于菌体的正常生长[20]。

3.5 pH

pH可以通过改变微生物表面的电荷影响微生物对营养物质的吸收，也可以通过改变蛋白质结构影响蛋白质功能，从而影响菌体的生长。不同pH对不同微生物的降解效果影响较大。Schizophyllumcommune降解孔雀石绿有很宽的pH适应性，在pH为 4.0～9.0时降解率均高于93.00%[42]。Trichaptumlaricinum在低pH条件下的脱色效果较差，当pH为6.0时，孔雀石绿(50 mg/L)3 h内脱色率高达90.00%，而在pH为3.6时其孔雀石绿脱色率几乎为零[25]。Citrobactersp.适合在偏碱性条件下降解孔雀石绿，在偏酸性条件下，降解率仅为15.00%，但pH为8.0时降解率为80.00%[36]。Burkholderiacepacia适合在偏酸性条件下对孔雀石绿进行脱色，pH为4.0时的孔雀石绿脱色率最高，为84.30%[40]。

3.6 盐度

含盐量过高会影响微生物细胞的渗透压，从而使微生物降低或丧失降解孔雀石绿的能力。Enterobactersp.在盐度为1.00%～4.00%的LB培养基中表现出稳定的孔雀石绿降解能力，均高于80.00%，当盐度增加至6.00%时，孔雀石绿降解率显著下降到56.00%[35]。也有研究筛选到了能够在高盐度下保持较好孔雀石绿降解能力的微生物，曾庆龙等[43]从污水厂底泥中筛选到一株耐盐菌，研究发现5.00%盐度对Escherichiasp.的孔雀石绿脱色没有明显影响。郑红叶[42]探究了在盐度达到20.40%时，Schizophyllumcommune对孔雀石绿的降解率仍有21.47%。目前，在高盐度下菌株对孔雀石绿降解的效果较差，筛选耐盐微生物对于在高盐环境下的孔雀石绿降解具有重要意义。

3.7 金属离子

金属离子可以诱使微生物降解酶的活性中心结构改变，使酶与底物的结合能力发生变化，改变降解酶的活力，从而影响微生物对孔雀石绿的降解效果。如Schizophyllumcommune对50 mg/L孔雀石绿的脱色率为77.71%，添加Zn2+能显著提高其孔雀石绿脱色率，达到90.48%，添加Mn2+和Fe2+分别使其孔雀石绿脱色率降低到73.98%和70.72%[42]。外加0.50 mmol/L Pb2+对Raoultellasp.有明显促进作用，孔雀石绿降解率从80.00%增加至95.00%以上[37]。金属离子Mg2+、Zn2+、Na+、K+和Cu+对Trichaptumlaricinum的脱色影响不明显，而Fe2+有很强的抑制作用，可能是因为Fe2+占据了孔雀石绿脱色酶的结合位点，改变了该酶的构象，从而使其失去脱色活性[25]。

4 微生物降解孔雀石绿的相关酶系

微生物降解孔雀石绿主要通过微生物所分泌酶的催化发挥作用，而报道较多的孔雀石绿相关酶主要有孔雀石绿还原酶、漆酶、锰过氧化物酶等[44]，具体如表4所示。

表4 微生物降解孔雀石绿相关的酶Tab.4 Enzymes related to malachite green degradation by microorganism

4.1 孔雀石绿还原酶

孔雀石绿还原酶在微生物降解孔雀石绿过程中发挥着重要作用，该酶能够将孔雀石绿还原为隐性孔雀石绿，一般认为，该催化反应是孔雀石绿降解的第一步反应。孔雀石绿还原酶有两种类型：膜结合型和胞质还原型，均需要依赖NADPH、NADH或FADH等还原型辅酶[45-46]。Kalyani等[47]研究发现Pseudomonasaeruginosa降解过程中，孔雀石绿还原酶活性在3 h内从7.34 U/mL增加至18.57 U/mL。Mukherjee等[48]进行酶学分析发现，与未添加孔雀石绿的培养基相比，24 h内Enterobacterasburiae的孔雀石绿还原酶酶活力增加了73.00%，表明孔雀石绿还原酶在Enterobacterasburiae降解孔雀石绿过程中发挥着重要作用。

4.2 漆酶

漆酶是一种多酚氧化酶，能够利用铜离子独特的氧化还原能力降解孔雀石绿。李雪英等[45]研究1.0 mmol/L 不同金属离子对漆酶活性的影响，发现Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe2+对漆酶具有激活作用，其中Cu2+激活作用最强，相对酶活为105.00%，金属离子K+、Mn2+和Zn2+对酶有一定的抑制作用，其中K+对酶具有较强的抑制作用，相对酶活为67.00%。Patil等[49]研究发现，5.00 U/mL粗漆酶能够在3 h内脱色81.00%的孔雀石绿。吕国英等[50]通过测定细胞内外酶活，发现漆酶酶活是其他酶酶活的几十倍，可以推测在脱色过程中漆酶起主要作用。Kupryashina 等[51]研究发现盐培养基中加入硝酸铵时孔雀石绿脱色率降低，原因可能是硝酸铵是酚氧化酶活性的特异性抑制剂，导致漆酶等酚氧基酶复合物的酶活性降低。

4.3 锰过氧化物酶

锰过氧化物酶是一种大多分离自白腐真菌的细胞外木质素酶。Yang等[52]研究发现在缺乏Mn2+和H2O2的条件下，孔雀石绿的脱色率从81.90%显著降低至7.70%；并且通过比较纯化和粗锰过氧化物酶降解孔雀石绿的能力，发现结果相差不大，反应50 min 孔雀石绿脱色率分别为90.30%和87.00%。Du等[53]通过添加1 mg/L不同金属离子发现，Mn2+明显促进了孔雀石绿的脱色，Mn2+可以作为Pseudomonassp.的锰过氧化物酶激活剂，说明Mn2+可能通过调节锰过氧化物酶的表达而影响孔雀石绿的降解效果，这一结果与张漾泓等[19]的研究结果相似。Alice等[54]研究发现Mn2+的添加可能促进浓度依赖型锰过氧化物酶基因的表达，从而促进菌株的孔雀石绿降解。

5 微生物降解孔雀石绿的产物及代谢路径

孔雀石绿的降解伴随着苯环的断裂，随之产生一些降解中间产物[46]。熊晶晶等[8]证实孔雀石绿降解产物为 4-二甲氨基-二苯甲酮。吴茵等[21]通过GC-MS观察到，微生物降解孔雀石绿后色谱峰基本消失，同时产生3个新的色谱峰，与GS-MS NIST library 进行比对，证实新产生的3种产物分别为4-氨基-二苯甲酮、4-二甲氨基-二苯甲酮和 4-甲氨基-二苯甲酮。

不同微生物降解孔雀石绿的产物如表5所示。结合文献报道，推测微生物降解孔雀石绿的可能路径如图1所示。刘菁华等[36]根据3 种降解产物即4-二甲氨基-二苯甲酮、N，N-二甲基苯胺和4-二甲氨基-苯酚，推测Citrobactersp.降解孔雀石绿的途径为：孔雀石绿首先经过羟基化反应生成孔雀石绿甲醇，孔雀石绿甲醇氧化分解为4-二甲氨基-二苯基甲酮和 N，N-二甲基苯胺，中间产物4-二甲氨基-二苯甲酮进一步分解，转化为次级代谢产物4-二甲氨基-苯酚和苯甲醛。孔雀石绿降解过程伴随着一系列酶催化反应。Kalyani等[47]认为孔雀石绿在还原酶作用下降解为隐性孔雀石绿，隐性孔雀石绿通过脱甲基酶进一步脱甲基化，得到二甲基衍生物，在漆酶、脱甲基酶作用下生成4-二甲氨基-二苯甲酮和苯胺，进一步脱甲基化得到中间体4-氨基-苯甲酮，4-氨基-苯甲酮进一步脱氨基，最终得到降解产物二苯胺。王邦国等[55]同样认为孔雀石绿降解为隐性孔雀石绿，经N-去甲基作用，生成初级或次级代谢产物芳香胺。然而，梅嬛等[37]从污泥中筛选到的Raoultellasp.在盐培养基中降解孔雀石绿时并没有隐性孔雀石绿的生成，证明菌株可能存在新的孔雀石绿降解途径。

表5 微生物降解孔雀石绿的产物Tab.5 Degradation products of malachite green by microorganism

图1 微生物降解孔雀石绿的可能代谢路径Fig.1 Possible metabolic pathways of malachite green degradation by microorganism

6 展望

迄今为止，国内外对微生物降解孔雀石绿的研究主要集中在降解菌的筛选、降解产物的鉴定及降解途径的预测，对微生物降解孔雀石绿的完整代谢途径至今尚未明确，今后有望借助转录组、蛋白质组、代谢组等多组学分析技术及分子生物学方法解析微生物与孔雀石绿降解相关的关键基因及代谢通路。由于水环境成分复杂，影响微生物降解的因素众多，因此，选择最佳的处理方法降解孔雀石绿是一项艰巨的任务。恶劣的环境因素可能会导致孔雀石绿降解酶和降解菌株失活。因此，有必要开发具有高稳定性、高产量、低成本、多功能的酶或菌株以满足孔雀石绿的降解。利用基因克隆、异源表达、基因重组等分子生物学技术，将孔雀石绿关键降解酶基因导入易于繁殖的菌株内进行表达，将是今后重要的研究方向。此外，针对运用单个菌株对孔雀石绿的降解不完全，采用混合菌群的协同降解可以抵御环境不良影响，显著提高其孔雀石绿降解活性，并且有利于将孔雀石绿完全降解为小分子化合物。因此，通过收集孔雀石绿高效降解菌种，利用混合菌群协同降解技术将是今后孔雀石绿微生物降解的重要应用方向。