miR-29b抑制LPS诱导的人支气管上皮细胞系16HBE的凋亡

袁 东，蒋瑶娜，李亚清

(1.蚌埠医学院 研究生院，安徽 蚌埠 233030;2.浙江中医药大学 第二临床医学院，浙江 杭州 310053;3.浙江省人民医院 呼吸内科，浙江 杭州 310014)

支气管上皮细胞在维持气道稳态中具有重要作用，其受到病原微生物等多种外界因素刺激以后，细胞凋亡水平升高，导致支气管上皮细胞功能异常，引起疾病发生[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌的细胞壁组成部分，其可以诱导支气管上皮细胞凋亡[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一类具有多种生物学作用的小分子RNA，其在自然界的多种真核生物体内表达，并且miRNA在不同的生理和病理阶段发挥的作用可能不同[3]。miRNA参与感染性疾病诱导的支气管上皮细胞损伤发生[4]。miR-29b属于miR-29成员之一，与细胞增殖、分化、代谢、衰老和凋亡等有关[5]。miR-29b与人类疾病发生有关，miR-29b可能是疾病治疗的分子靶点[6]。既往研究证实，miR-29b与呼吸系统疾病有关，其参与调控气道上皮细胞重塑过程，miR-29b能够抑制细胞损伤[9]。目前对miR-29b在LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡中的作用还不明确。本研究以人支气管上皮细胞系16HBE作为体外研究对象，以LPS体外诱导16HBE细胞为凋亡模型，探讨miR-29b对支气管上皮细胞凋亡的影响，为靶向分子治疗支气管上皮细胞损伤提供可能思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人支气管上皮细胞系(human bronchial epithelial cell line,16HBE)(北京北纳创联生物技术研究院)；pcDNA-CHOP、pcDNA[和元生物技术(上海)股份有限公司]；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，c-caspase-3)抗体(Abcam公司)(CTS公司)；mimics control、miR-29b mimics(上海吉玛制药技术有限公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；miR Vana miRNA提取试剂盒(Ambion公司)；miRNA qRT-PCR试剂盒(Clontech 公司)；CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein C/EBP,CHOP)抗体(北京百奥莱博科技有限公司)；糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗体(StressMarq公司)；LPS(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:将16HBE分成对照control、LPS(50 μg/mL的LPS处理)、转染mimics control组、转染miR-29b mimics组，LPS、LPS+NC、转染miR-29b mimics组细胞在实验0 h时，均用含有LPS浓度为50 μg/mL的细胞培养液培养；LPS+NC、转染miR-29b mimics组细胞分别使用转染mimics control、miR-29b mimics后的支气管上皮细胞。支气管上皮细胞汇合度为60%～70%时，进行细胞转染，转染试剂为Lipofectamine 2000，转染步骤按照转染试剂操作说明进行。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-29b表达：利用miR Vana miRNA提取试剂盒提取RNA，用miRNA RT-qPCR试剂盒进行PCR扩增。cDNA合成反应体系如下：5 μL的mRQ缓冲液、3.75 μL的RNA样品、1.25 μL的mRQ Enzyme，放在37 ℃孵育1 h，在85 ℃孵育5 min。PCR反应体系为：12.5 μL的SYBR Advantage Premix、0.5 μL的ROX Dye、0.5 μL的miRNA-specific primer、0.5 μL的mRQ 3′primer、2 μL的cDNA，添加ddH2O至25 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。引物序列为：miR-29b上游：5′-GCG CTAGCACCATTTGAAAT，下游：5′-CAGTGCAGGGT CCGAGGT-3′；内参U6上游：5′-CGATACAGAGAA GATTAGCATGGC-3′，下游：5′-CTGCAGGAGGCATT GCTGAT-3′。以2-△△Ct法计算miR-29b水平。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：按照每孔100 μL的细胞悬液接种到96孔板内，每孔内加4×103个细胞。培养24 h后，在每孔内加15 μL的MTT，继续放置在37 ℃孵育培养4 h。然后，将细胞中的上清溶液弃掉，添加150 μL的二甲基亚砜溶液，结合10 min以后，用酶标仪测定每个孔的A值，经过空白孔调零以后，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值÷对照组A值)×100%。

1.2.4 流式细胞测量术检测细胞凋亡：细胞培养24 h后，用预冷的PBS溶液分别将各组细胞重悬洗涤2次，最后将细胞制成单细胞悬浮液，浓度为106个/mL。收集1 mL细胞悬浮液，900×g离心10 min，弃上清，添加195 μL的结合缓冲液悬浮细胞，然后加入5 μL的annexin V-FITC溶液，避光条件下、室温反应15 min，然后加入PI溶液5 μL，继续孵育15 min。用流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot检测c-caspase-3、c-caspase-12、GRP78和CHOP蛋白表达:细胞培养24 h之后，用PBS润洗细胞2次，然后在细胞内添加含有10 μL PMSF的RIPA裂解溶液1 mL，用细胞刮刀收集细胞，转移到离心管内，以12 000 ×g离心10 min，将上清溶液收集并放在-80 ℃保存。按照BCA方法检测蛋白浓度。制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，按照每个孔内上样量30 μg蛋白样品计算，在蛋白样品内添加等量的上样缓冲液，混合煮沸，上样。首先使用90 V的电压电泳，等到样品进入分离胶前，把电压升高到120 V继续电泳。电泳结束以后，撬开玻璃，取出凝胶，泡在转移缓冲液中准备转膜。以240 mA的电流转膜3 h。将PVDF膜取出，浸泡在5%牛血清白蛋白溶液中，于室温环境孵育2 h；然后将PVDF膜放在一抗稀释液中，摇床4 ℃过夜；最后将PVDF膜放在二抗稀释液中，摇床室温孵育2 h。用ECL发光，分析条带的A值，以GAPDH作为内参，分析c-caspase-3、c-caspase-12、GRP78和CHOP蛋白表达变化。c-caspase-3、c-caspase-12一抗均按照1∶600稀释，GRP78和CHOP一抗均按照1∶1 000稀释，二抗按照1∶4 000稀释。

1.2.6 CHOP对miR-29b mimics调控支气管上皮细胞增殖和凋亡作用的检测:在16HBE细胞中共转染miR-29b mimics、pcDNA和miR-29b mimics、pcDNA-CHOP，然后用含有LPS(50 μg/mL)的细胞培养液培养，记为转染miR-29b mimics、pcDNA组和转染miR-29b mimics、pcDNA-CHOP组，细胞培养后24 h，用MTT方法测定增殖(步骤参照1.2.3)，流式细胞测量术检测凋亡(步骤参照1.2.4)，Western blot测定c-caspase-3、c-caspase-12、CHOP蛋白表达(步骤参照1.2.5)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-29b mimics对LPS条件下支气管上皮细胞中miR-29b表达影响

LPS组细胞中miR-29b水平明显低于对照组(P<0.05)；转染miR-29b mimics组细胞中miR-29b水平明显高于转染mimics control组(P<0.05)。miR-29b mimics提高LPS诱导的16HBE中miR-29b表达水平(图1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with transfection mimics control group图1 转染miR-29b mimics后LPS诱导的支气管上皮细胞中miR-29b表达水平Fig 1 Expression level of miR-29b in bronchial epithelial cells induced by LPS after trans- fection of miR-29b n=9)

2.2 miR-29b mimics对LPS条件下支气管上皮细胞增殖和凋亡影响

LPS组较对照组细胞存活率降低，凋亡率和c-caspase-3、c-caspase-12蛋白水平升高(P<0.05)；与转染mimics control组比，转染miR-29b mimics组细胞存活率升高，凋亡率和c-caspase-3、c-caspase-12蛋白水平降低(P<0.05)。miR-29b mimics提高LPS诱导的16HBE增殖能力，减少细胞凋亡(图2)。

2.3 miR-29b mimics对LPS条件下支气管上皮细胞内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP表达影响

与对照组比,LPS组细胞GRP78和CHOP蛋白水平升高(P<0.05)；与转染mimics control组比，转染miR-29b mimics组细胞GRP78和CHOP蛋白水平降低(P<0.05)。miR-29b mimics抑制LPS诱导的16HBE内质网应激(图3)。

2.4 pcDNA-CHOP对miR-29b mimics影响LPS条件下支气管上皮细胞CHOP蛋白表达作用

与转染miR-29b mimics、pcDNA组比较，转染miR-29b mimics、pcDNA-CHOP组细胞CHOP蛋白水平升高(P<0.05)(图4)。

A.cell survival rate;B.flow cytometry detection of apoptosis results;C.cell apoptosis rate;D.Western blot detection of c-caspase-3 and c-caspase-12 protein expression results;E.C-caspase-3,c-caspase-12 protein expression level;*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with transfection mimics control group图2 miR-29b mimics对LPS诱导的16HBE增殖、凋亡和c-caspase-3、c-caspase-12蛋白表达影响Fig 2 Effect of miR-29b mimics on the proliferation and apoptosis and the expression of c-caspase-3 and c-caspase-12 proteins induced by LPS in 16HBE n=9)

A.Western blot detection of GRP78 and CHOP protein expression;B.GRP78 and CHOP protein expression level;*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with transfection mimics control group图3 miR-29b mimics对LPS诱导的16HBE细胞中GRP78和CHOP蛋白表达影响Fig 3 Effect of miR-29b mimics on GRP78 and CHOP protein expression by LPS in 16HBE n=9)

A.Western blot detection of CHOP protein expression;B.CHOP protein expression level;*P<0.05 compared with transfection miR-29b mimics and pcDNA group图4 miR-29b mimics和pcDNA-CHOP对LPS诱导的16HBE细胞中CHOP蛋白表达影响Fig 4 Effect of miR-29b mimics and pcDNA-CHOP on the expression of CHOP protein in 16HBE cells induced by n=9)

2.5 pcDNA-CHOP对miR-29b mimics影响LPS条件下支气管上皮细胞增殖、凋亡作用

与转染miR-29b mimics、pcDNA组比较，转染miR-29b mimics、pcDNA-CHOP组细胞存活率降低，凋亡率升高，c-caspase-3、c-caspase-12蛋白表达水平升高(P<0.05)。pcDNA-CHOP逆转miR-29b mimics对LPS诱导的16HBE细胞增殖、凋亡影响(图5)。

3 讨论

LPS是常见的体外研究支气管上皮细胞损伤的诱导因子，其刺激以后的支气管上皮细胞凋亡水平增加，细胞增殖能力降低[8]。本次实验表明，LPS处理以后的支气管上皮细胞增殖活性下降，细胞凋亡水平升高，提示LPS诱导支气管上皮细胞凋亡，这与以前的研究结果相一致，说明成功构建了体外支气管上皮细胞损伤模型。

不同发育或生理、病理阶段的miRNA的表达谱不同，其作用也可能不同[9]。miR-29b是一个在人体内多种组织中表达的调节因子，参与缺血再灌注损伤等多种疾病的发生以及进展[10]。以前的研究发现，miR-29b与呼吸系统疾病有关，miR-29b在肺阻塞中低表达，miR-29b与气道上皮细胞重塑有关[7]。本研究结果显示，LPS处理以后的支气管上皮细胞中miR-29b的表达水平降低，并且上调miR-29b可以提高LPS条件下支气管上皮细胞增殖能力，抑制细胞凋亡，这说明miR-29b具有改善支气管上皮细胞损伤的作用。

内质网可以被多种因素激活，如饥饿、缺氧、药物等，这些刺激因素能够激发内质网、胞核信号传导，最终诱导细胞对存活的适应或细胞凋亡发生[11]。CHOP是由内质网应激诱导产生，调控细胞存活和凋亡的调节因子[12]。GRP78是一种内质网伴侣蛋白，其表达水平的高低与细胞内内质网应激水平有关[13]。Caspase-12和caspase-3均属于caspase蛋白家族成员，其在正常情况下以没有活性的形式存在，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡发生，caspase-12是内质网应激介导细胞凋亡的关键[14]。caspase-12激活后可以诱导caspase凋亡级联反应下游因子caspase-3的活化，从而诱导细胞凋亡发生[15]。本实验表明，LPS处理后的支气管上皮细胞中c-caspase-3、c-caspase-12、GRP78和CHOP蛋白表达水平均升高，而上调miR-29b后的支气管上皮细胞中c-caspase-3、c-caspase-12、GRP78和CHOP蛋白表达水平均降低，说明miR-29b能够减少LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡。本研究还发现，上调CHOP可以减弱miR-29b对支气管上皮细胞凋亡抑制作用，说明miR-26b通过内质网应激途径调控LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡。

A.cell survival rate;B.flow cytometry detection of apoptosis results;C.cell apoptosis rate;D.Western blot detection of c-caspase-3 and c-caspase-12 protein expression results;E.C-caspase-3.c-caspase-12 protein expression level;*P<0.05 compared with transfection miR-29b mimics and pcDNA group图5 miR-29b mimics和pcDNA-CHOP对LPS诱导的16HBE细胞凋亡和c-caspase-3、c-caspase-12蛋白表达影响Fig 5 Effects of miR-29b mimics and pcDNA-CHOP on LPS-induced 16HBE cells apoptosis and c-caspase-3 and c-caspase-12 protein n=9)

总之，miR-29b可以通过内质网应激途径减少LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡。本实验为研究miR-29b在感染性疾病诱导的支气管上皮细胞凋亡中的作用提供了参考，为分子靶向改善支气管上皮细胞损伤提供了新方向。