槐果碱减轻低氧导致的大鼠心肌细胞系H9c2损伤

卢厚新，杨清泉，郭 石

(1.南阳市中心医院 全科医学科，河南 南阳 473000;2.开封市儿童医院 药学部，河南 开封 475000)

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是影响全世界人类生命健康的主要疾病之一[1]。低氧应激是IHD心肌细胞损伤的主要原因，其可通过促进细胞色素C从线粒体释放到细胞质，进而激活胱天蛋白酶级联反应，最终诱导心肌细胞凋亡[2]。心肌细胞凋亡是导致IHD的心脏功能障碍的主要原因之一[3]。因此，减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡是预防和治疗IHD的重要策略之一。

传统中草药具有多种生物活性的天然化合物，其具有良好的治疗功效，且副作用极小，这为开发IHD药物提供了重要的来源[4]。槐果碱(sophoridine，Sop)是一种从豆科植物槐、刺槐和茎槐的茎和叶中分离出来的具有抗感染、抗病毒和抗癌等多种药理活性的喹唑烷类生物碱[5]。本研究主要探讨Sop对低氧引起的心肌细胞系H9c2损伤的影响并分析其机制，其将为进一步阐明Sop在IHD预防和治疗中的有益作用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验试剂

大鼠心肌细胞系H9c2(myocardial cell line H9c2)和FITC-annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(武汉普诺赛生命科技有限公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；青霉素、链霉素和槐果碱(Sop，HPLC纯度>98%)(Sigma-Aldrich公司)；MTT试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒、丙二醛(malonyldialdehyde，MDA)测定试剂盒和细胞裂解液(上海碧云天生物科技有限公司)；二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合的山羊抗兔IgG(H+L)二抗(广州赖德生物技术有限公司)；兔单克隆一抗cleaved-caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT(Cell Signaling Technology公司)和β-actin(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和分组处理：将H9c2细胞接种在补充有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。

将细胞分为对照组、低氧模型组(细胞置于含有1% O2、5% CO2和94% N2的低氧舱中48 h)和低氧+低、中、高浓度槐果碱处理组(从低氧开始时分别加入1、4和16 mmol/L的槐果碱处理细胞48 h)。

1.2.2 MTT法测定细胞活力：将各组细胞以5×103个/孔接种在96孔板中，向每个孔中添加20 μL MTT试剂(5 g/L)，再培养4 h，然后每孔添加100 μL二甲基亚砜溶解结晶。用自动酶标仪在波长560 nm处测量吸光度值。

1.2.3 测定LDH释放水平：将各组细胞以5×103个/孔接种在96孔板中，收集培养基上清液。按照LDH测定试剂盒说明书步骤操作，用自动酶标仪在波长490 nm处测量吸光度值。

1.2.4 测定MDA的含量：收集各组细胞，用细胞裂解液裂解细胞。将裂解的细胞离心，收集上清液，并用BCA试剂盒法对蛋白定量。取裂解的上清液并根据MDA测定试剂盒说明书步骤进行MDA水平的测量。将MDA含量用蛋白含量进行归一化处理。

1.2.5 流式细胞测量术检测细胞凋亡：收集分组细胞，按照FITC-annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤，分别将其重悬于200 μL含有10 μL FITC-annexin V的结合缓冲液中，并在暗室中室温孵育30 min，然后将加入300 μL 含有5 μL PI结合缓冲液并在暗室中室温孵育10 min。用流式细胞仪分析样品，并用FlowJo 7.2.4软件计算细胞凋亡水平。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达量：收集分组细胞，并裂解缓冲液分离出蛋白。用BCA(英文全称)蛋白质定量试剂盒对各组蛋白浓度的浓度进行定量。每组样品取30 μg蛋白进行Western blot电泳。将电泳分离的蛋白电转到聚偏氟乙烯(polyvinyli-dene fluoride，PVDF)膜，并经封闭后，分别室温孵育1∶1 000稀释比例的一抗(cleaved-caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和β-actin)2 h。洗涤膜后，再室温孵育1∶1 000稀释比例的HRP缀合的山羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h。再次洗涤膜后，用ECL试剂显影，并用ChemiDocTMXRS系统拍照蛋白质条带。使用Image LabTM软件对条带的吸光度值进行定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 槐果碱(Sop)恢复低氧诱导的H9c2细胞的细胞损伤

对照组细胞形态正常，低氧模型组中细胞稀疏并出现拉丝状况，低氧+低、中、高浓度Sop处理组中低氧导致的拉丝情况明显改善且细胞数目明显增加(图1A)。与对照组相比，低氧模型组细胞活性明显降低(P<0.001)；与低氧模型组相比，Sop以浓度依赖性方式增加细胞活力(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(图1B)。

2.2 槐果碱(Sop)减少低氧诱导的H9c2细胞的LDH释放和MDA含量

与对照组相比，低氧模型组LDH的释放和MDA含量均明显增加(P<0.001)，而Sop处理则浓度依赖性抑制低氧导致的LDH的释放和MDA含量(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(图2)。

A.representative phase contrast microscope images of cells in each group;scale bar=50 μm;B.statistical results of cell viability in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group (Hyp)图1 各组H9c2细胞形态与活力Fig 1 Cell morphology and cell viability of H9c2 cells in each n=4)

A.statistical results of LDH release in each group;B.statistical results of MDA content in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group(Hyp)图2 各组H9c2细胞LDH释放量和MDA含量Fig 2 LDH release and MDA content of H9c2 cells in each n=4)

2.3 槐果碱(Sop)减少低氧诱导的H9c2细胞凋亡

与对照组相比，低氧模型组细胞凋亡明显增加(P<0.001)，而槐果碱处理则浓度依赖性地抑制低氧导致的细胞凋亡(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(图3)。

2.4 槐果碱(Sop)降低低氧导致的H9c2细胞cleaved-caspase-3表达和增强PI3K/AKT信号活性

与对照组相比，低氧模型组cleaved-caspase-3表达明显增加(P<0.001)，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比率均明显降低(P<0.001)，而Sop处理则浓度依赖性地缓解上述指标变化(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(图4)。

3 讨论

氧气供应不足是造成IHD中心肌细胞受损的最重要的病理生理机制之一[2,6]。此项研究证实了槐果碱能缓解低氧引起的大鼠心肌细胞系H9c2损伤，提示，槐果碱是潜在的抗IHD的药物。

低氧引起的氧化还原能力过强是由于ROS生成过多和抗氧化系统受损所致[7]。MDA含量可间接反映细胞过氧化损伤程度[7]，LDH是细胞损伤的重要标志[8]。本研究提供的证据表明：Sop可通过抗氧化作用抑制了低氧诱导的H9c2细胞损伤，主要体现在其减少低氧导致的MDA蓄积和LDH生成所实现的。过度的氧化应激可导致细胞活性降低和细胞凋亡的发生[7-9]。本研究结果显示：低氧环境显著抑制了心肌细胞的活力并诱导了细胞凋亡，而Sop治疗可逆转上述指标。为进一步证实Sop对低氧诱导的H9c2细胞的抗凋亡活性，在本研究中检测了凋亡标志蛋白cleaved-caspase-3[9]，结果表明：Sop在低氧环境中呈剂量依赖性降低H9c2细胞中cleaved-caspase-3的表达。

PI3K/AKT通路在细胞存活中起着关键作用，尤其是在低氧环境下[10-11]。低氧可通过降低PI3K/AKT信号活性，从而导致使心肌细胞凋亡[11]。有研究显示，Sop通过抑制氧化应激、炎性反应和细胞凋亡来减轻LPS引起的肝损伤[12]。本研究发现：低氧可显著灭活H9c2细胞中的PI3K/AKT信号活性，而Sop治疗可缓解H9c2细胞中低氧引起的PI3K/AKT信号的失活。这些结果表明，Sop可能通过激活PI3K/AKT信号活性来缓解低氧引起的心肌细胞损伤。

A.representative flow cytometry scatter images in each group;B.statistical results of apoptosis in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group(Hyp)图3 Sop对各组H9c2细胞凋亡的影响Fig 3 Effects of Sop on the apoptosis of H9c2 cells in each n=4)

A.the bands representing the protein expressions of cleaved-caspase-3,PI3K,p-PI3K,AKT,and p-AKT in each group;B.relative gray value of cleaved-caspase-3;C.statistical results of the expression of cleaved-caspase-3,and the ratios of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT in each group;#P<0.001 compared with the control group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with the hypoxia model group (Hyp)图4 各组H9c2细胞中cleaved-caspase-3、p-PI3K和p-AKT蛋白表达情况Fig 4 Expressions of cleaved-caspase-3,p-PI3K and p-AKT of H9c2 cells in each n=4)

综上所述，本研究验证了Sop能减轻低氧引起的心肌细胞损伤，其作用可能与Sop抗氧化作用以及激活PI3K/AKT通路信号活性相关。本研究结果为明确Sop在IHD中的有益作用提供了理论和实验依据。