人源Lactobacillus reuteri 协同发酵薏米酸奶的品质分析

朱晓丽，杨周洁，文安燕，秦礼康

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）（2.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025）

益生菌（probiotics），作为改善寄主肠道微生态作用的活性微生物[1]，具有增强免疫力[2]、降低胆固醇和延缓衰老[3]等作用。酸奶具有良好的生理功能和丰富的营养物质，是开发功能性食品的理想选择[4]。含有益生菌的酸奶有改善胃肠道[5]和降血脂[6]功效。益生菌产品以乳制品为主，益生菌发酵的酸奶将益生菌本身的发酵性能与酸奶的保健功效结合达到协同作用[7]。益生菌乳制品主要有发酵乳、乳酸菌饮料、干酪、酸奶、乳饮料、奶粉和冰淇淋等等[8]，酸奶产品中益生菌的添加为消费者提供了有益的功能[9]。

薏苡（Coixlacryma-jobiL.）为禾本科玉蜀黍族薏苡属，被誉为“世界禾本科植物之王”，其成熟种仁称为“薏米”[10]。薏米富含蛋白质、脂肪、淀粉、矿物质、维生素等营养成分，以及薏仁酯、薏仁油、三萜、谷甾醇、生物碱等活性成分，薏米有降压、降糖、消炎、抑制癌细胞增殖等生理功能[11]。薏米被应用于各种功能保健食品，研究发现，薏米浆与鲜奶发酵后，营养成分更丰富，口味更好[12]。

目前，市售的酸奶大多采用Lactobacillus bulgaricus和Streptococcus thermophilu发酵，但它们耐酸耐胆盐及粘附定殖效果较差，有益作用受到限制[13]。Lactobacillus reuteri作为益生菌已经被我国批准可用于乳制品、保健食品[5]，它有止泻[14]、增强机体免疫[15]、拮抗病原微生物[16]和调节肠道菌群[17]等功能。同时，Lactobacillus reuteri耐酸耐碱能力较强，为其在肠道内定殖并发挥益生功能创造必要条件[13]。从前期实验对适合罗伊氏乳杆菌生长的功能谷物的筛选得出，薏米能显著促进Lactobacillus reuteri的生长，活菌数量级高达1013cfu/mL，罗伊氏乳杆菌单菌株发酵存在凝乳效果差的缺点。因此，本文采用Lactobacillus reuteri分别与Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus协同发酵制备薏米酸奶，剖析其理化指标、质构特性、滋味及挥发性风味物质，以期为Lactobacillus reuteri的应用及薏米产品的深入研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lactobacillus reuteri（保藏号BNCC No：186563）购于北京北纳创联生物技术研究院；Streptococcus thermophilus（保藏号CICC No：6247）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；Lactobacillus bulgaricus（保藏号GDMCCNo：1.155）购于广东省微生物保藏中心；薏米、鲜牛奶、白砂糖均市售，MS 培养基、MS 肉汤培养基、酚酞、氢氧化钠、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、草酸、磷酸、磷酸二氢钾等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Pegasus HRT 4D Plus（LECO，USA）全二维气相-高通量高分辨质谱联用仪；1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；TS-500Z 电子舌味觉分析系统，日本Insent 公司；TMS-Pro 质构分析仪，美国Food Technology Corporation 公司；JK9870 全自动凯氏定氮仪；pH-25 型pH 计，上海今迈仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米酸奶的制备

以1:5 的料液比加入纯净水浸泡薏米24 h，煮1.5 h，打浆，加0.3%（中温）α-淀粉酶，55 ℃糊化1 h，加入0.5%糖化酶58 ℃糖化50 min，120 目尼龙布过滤。6%白砂糖、薏米浆30%、鲜牛奶混合均质。95 ℃下灭菌5 min，冷却，接入5% 1:1:1 的菌种，41 ℃发酵6 h，酸奶于4 ℃冷藏24 h，得到薏米酸奶成品。

表1 样品详细信息Table 1 Sampledetails

表2 薏米酸奶理化指标Table 2 Physical and chemical indexes of semen coicis yogurt

表3 薏米酸奶质构分析Table 3 Texture analysis of semen coicis yogurt

1.3.2 常规理化指标测定

滴定酸度参照LIM[18]方法；持水率参考FENGC[19]方法；手持pH 计测定pH 值；活菌数的测定采用平板计数法；蛋白质含量的测定参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》。

1.3.3 TPA 测试

酸奶的质构测定参考FANG T[20]等的方法略作修改，测试采用连接25N 感应元的质构仪，使用直径为50 mm 探头，测试速率60 mm/min、形变量30%。

1.3.4 有机酸测定

有机酸的测定参照王雪艳[21]等的方法略作修改。色谱条件：磷酸二氢钾溶液（0.02 mol/L）；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。

1.3.5 电子舌的测定分析

电子舌的测定分析参考王一然[22]的方法略作修改，取适量体积的酸奶5000 r/min 离心10 min，加2倍体积的超纯水稀释，取25 mL于电子舌专用杯测定。

1.3.6 挥发性风味物质的测定

挥发性风味物质的测定参MOINEAU-JEAN A[23]的方法略作修改，采用SPME-GC-MS 技术对酸奶进行定性及定量分析。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 22.0和Excel处理软件对数据进行统计分析，实验重复三次，Duncan 检验法进行差异显著性分析，p＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 理化指标

酸奶的pH 和滴定酸度取决于菌种种类、接菌比例和菌种产酸能力，酸度是衡量酸奶品质的重要指标[24]。由表2 可以看出，薏米酸奶pH 在4.04～4.43，滴定酸度在80.66～96.65 °T，而RTB 滴定酸度是80.66 °T，显著低于其他两菌发酵的酸奶（p＜0.05），这与温夏萍[25]研究结论一致，Lactobacillusreuteri发酵乳糖主要产生乳酸、碳酸和乙酸，碳酸不稳定易分解成二氧化碳挥发；薏米酸奶持水率在36.76%～44.80%，TB 的持水率为44.80%，显著高于RTB、RT 和RB（p＜0.05）；RTB 中活菌数达到9.99 log cfu/mL，显著高于2 株菌发酵的酸奶，这与前期实验结果一致，薏米促进Lactobacillus reuteri的生长（p＜0.05）；薏米酸奶的蛋白质含量无显著差异（p＜0.05）。

2.2 TPA

酸奶的硬度、弹性和内聚性是评价其质构特性的重要指标[26]。酸奶的凝乳结构主要是由酪蛋白、脂肪和乳清三部分形成的三维网状凝胶结构[22]。由表3 可知，RTB 酸奶咀嚼性（0.45 mj）、内聚性（0.77 Ratio）、胶黏性（0.05 N）均显著高于其他三个组，而硬度（0.69 N）、弹性（8.99 mj）显著高于RT 和RB，略低于TB（p＜0.05），说明3 株菌发酵赋予薏米酸奶柔和的口感，表明3 株菌发酵薏米酸奶的整体凝固性较好，较黏稠，符合凝固型酸奶质构特性。

2.3 有机酸成分分析

有机酸与发酵乳品质紧密相关[27]。由表4 可知，RTB、RT、RB和TB中有机酸含量分别是14.27、15.08、14.92、21.04 mg/mL。TB 中乳酸、柠檬酸含量最高，RTB 中乙酸（0.79 mg/mL）含量显著高于其它两菌发酵的酸奶（p＜0.05），RB 中草酸（0.26 mg/mL）和酒石酸（0.84 mg/mL）含量最高。这与陈永福[28]研究结论一致，乳酸和柠檬酸是酸奶中的主要有机酸，酸奶的乳酸和柠檬酸与滴定酸度呈正相关，乙酸与滴定酸度呈负相关，这解释了RTB 中滴定酸度低和pH 高的结果。

表4 薏米酸奶中有机酸分析（mg/mL）Table 4 Analysis of organic acids in semen coicis yogurt

2.4 电子舌

滋味是由酸、咸、鲜、甜、苦味组合而成，在酸奶中，这些人体能够鉴别的基本味觉主要由酸奶中非挥发性物质的组成及含量有关[29]。由图1 可知，四个样酸、甜、苦、鲜和咸味觉响应值均存在差异，酸味差异性最大，其次是鲜、咸、苦、甜涩（p＜0.05），RTB甜味和鲜味最强，苦味、涩味和酸味最弱。

图1 酸奶味感雷达图Fig.1 Yogurt taste radar map

2.5 挥发性风味物质分析

图2 薏米酸奶香气成分GC-MS 分析总离子流色谱图Fig.2 Chromatogram of total ion flow of semen coicis yogurt aroma components analyzed by gc-ms

醇、醛、酮、酸、脂等共同决定了酸奶的风味[30]，风味是决定酸奶的可接受性和选择性的重要因素[31]。由表5 可知，RTB、RT、RB 和TB 检测出总的风味物质依次为81 种（1331.74 ng/mL）、68 种（448.88 ng/mL）、73 种（388.74 ng/mL）和50 种（808.31 ng/mL），加入Lactobacillus reuteri提高了薏米酸奶的风味物质种类和含量。

酸类物质是酸奶重要的风味物质，主要表现在酸奶的滋味上，RTB、RT、RB 和TB 检测出的酸分别为11 种（467.31 ng/mL）、10 种（224.58 ng/mL）、10 种（149.16 ng/mL）和8 种（263.06 ng/mL），酸奶样品中检测到含量较高的四种酸分别是辛酸、己酸、葵酸（87.52 和乙酸，且RTB 中辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）、葵酸（87.52 ng/mL）和乙酸（84.67 ng/mL）显著高于其它2 株菌发酵的酸奶（p＜0.05），RTB 中乙酸含量较高这与Vénica C I 研究一致，益生菌通过异发酵途径生产乙酸有关[32]。癸酸能增加酸奶奶香味，己酸具有的椰果香味，戊酸表现出奶油香味，丁酸、庚酸具有奶酪香[33]。这些特殊的酸赋予了薏米酸奶独特的味道。

醇类物质的阈值较高，对酸奶风味物质的影响很小，但是醇可转化为酸，也是必不可少的一类物质。RTB、RT、RB 和TB 检测出的醇依次为18 种（167.75 ng/mL）、11 种（108.16 ng/mL）、14 种（85.11 ng/mL）、10 种（104.09 ng/mL）。四个样中含量较高的四种醇分别是乙醇（38.16 ng/mL）、2-壬醇（53.43 ng/mL）、2,3 丁二醇（28.65 ng/mL）和4-庚醇（11.70 ng/mL），2-壬醇和4-庚醇在RTB 中最高，乙醇和2,3 丁二醇在RT 中最高。

酮类物质由多不饱和脂肪酸的氧化、热降解，氨基酸降解或微生物代谢产生[34]。RTB、RT、RB 和TB检测出的酮依次为14 种（599.11 ng/mL）、10 种（21.18 ng/mL）、9 种（51.86 ng/mL）、10 种（388.83 ng/mL）；酸奶在发酵过程中经过复杂的生物化学反应，使酸奶具有特有的风味，在所有风味物质中2-壬酮含量最高，为341.94 ng/mL，它能够给酸奶提供独有的清香味，RTB 中2-壬酮含量显著高于其它两菌发酵酸奶。3-羟基-2-丁酮具有浓郁的奶香味，在RTB 中含量最高，达到34.81 ng/mL；丁二酮具有浓郁的奶油味，在RTB中含量最高，达到3.34 ng/mL；2-庚酮有类似梨的水果香味，在RTB 中含量为111.62 ng/mL 显著高于其它两菌发酵酸奶。2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香气，并带有坚果香，只在RTB 中检测到。

表5 薏米酸奶主要风味物质种类与含量分析Table 5 Main flavor substances and content analysis of semen coicis yogurt

烯烃类酮类36 11.15 甲酸己酯 - 3.68±0.04a - -37 11.76 辛酸甲酯 C9H18O2 - 0.28±0.02a - -38 12.36 辛酸乙酯 C10H20O2 0.02±0.01c 0.64±0.01a 0.16±0.01b -39 14.88 苯甲酸甲酯 C8H8O2 0.42±0.04d 1.23±0.01a 0.69±0.05c 0.81±0.01b 40 15.39 苯甲酸乙酯 C9H10O2 0.36±0.02a 0.15±0.01c 0.19±0.01b -41 15.85 丙烯酸异冰片酯 C13H20O2 0.23±0.04c 0.93±0.03a 0.45±0.03b -42 17.06 乙酸-5-十二烯醇酯 C14H26O2 - - - 5.37±0.11a 43 17.57 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯 C16H30O4 0.54±0.01a - - 0.54±0.05a 44 17.67 2-甲基丙酸酯 C12H24O3 - - 0.14±0.01a -45 18.42 马来酸二丁酯 C12H20O4 - 0.17±0.02a - -46 20.81 硬脂酸甲酯 C19H38O2 - - - 0.40±0.02a 47 20.81 棕榈酸甲酯 C17H34O2 1.09±0.02a 0.71±0.01b 0.70±0.02b -48 20.86 丁位癸内酯 C10H18O2 - 0.89±0a - -49 21.14 棕榈酸乙酯 C18H36O2 39.61±0.79a 31.80±0.47b 22.56±0.31c 15.60±0.51d 50 22.35 酞酸二乙酯 C12H14O4 - 0.54±0.31a 0.07±0.00b -51 23.33 反油酸乙酯 C20H38O2 9.32±0.13a 6.74±0.16b 4.76±0.12c 2.64±0.07d小计 53.44±1.13a 49.38±1.30a 30.36±1.03b 25.41±1.13d 52 8.93 双戊烯 C10H16 0.45±0.09a 0.19±0.01b - -53 9.94 苯乙烯 C8H8 0.49±0.10a 0.56±0.06a 0.37±0.02b 0.35±0.05b 54 12.68 2,4-二甲基苯乙烯 C10H12 - - 0.55±0.42a -55 13.46 氟乙烯 C2H3F - - 0.08±0.00a -小计 0.93±0.01a 0.76±0.01b 1.01±0.03a 0.35±0.05b 56 5.50 2,3-丁二酮 C4H6O2 3.34±0.11a 2.54±0.09b 2.01±0.07c 1.39±0.10d 57 5.50 2-戊酮 C5H10O 5.38±1.04a 58 6.73 2,3-戊二酮 C5H8O2 0.25±0.01a - - -59 8.23 3-庚酮 C7H14O - 0.14±0.00a 0.03±0.00b -60 8.72 2-庚酮 C7H14O 111.62±0.73a 4.66±0.04c 9.6±0.56c 54.33±1.11b 61 9.11 4-甲基-2-己酮 C7H14O 1.13±0.00a - - -62 9.84 5-甲基-3-庚酮 C8H16O - 0.17±0.01a - -63 10.36 3-羟基-2-丁酮 C4H8O2 34.81±1.58a 4.64±0.13c 4.45±0.12c 20.60±0.73b 64 11.40 2-羟基-3-戊酮 C5H10O2 0.42±0.01a - - -65 11.79 2-壬酮 C9H18O 341.94±3.11a 6.34±0.48d 24.01±0.67c 243.80±3.63b 66 14.47 甲基壬基甲酮 C11H22O 84.66±1.17a 3.29±0.03d 9.90±0.20c 47.38±1.05b 67 15.25 苯乙酮 C8H8O 0.53±0.01a 0.39±0.07b 0.24±0.05c 0.25±0.04c 68 16.85 2-十三烷酮 C13H26O 17.10±1.23a 0.87±0.03d 2.49±0.13c 9.54±0.45b 69 17.34 香叶基丙酮 C13H22O 0.68±0.05a - 0.14±0.02b -70 19.00 2-十五烷酮 C15H30O 2.74±0.23a - - -71 19.01 十七烷酮 C17H34O 0.12±0.01c 0.58±0.04b - 1.19±0.03a 72 23.25 2,6-二苯亚甲基环己酮C15H29NO3 1.60±0.02b - - 4.97±0.02a小计 599.11±4.18a 21.18±0.71d 51.86±1.31c 388.83±3.81b

注：“-”表示未检出。

酯类物质是酸奶的重要风味物质。酸奶酯类物质主要通过脂肪酸水解以及微生物的代谢生成，特别是原料乳中的短链脂肪酸水解会产生甲基酮和内酯，能够直接影响酸奶的整体风味。RTB、RT、RB 和TB中检测出的脂为11 种（53.44 ng/mL）、14 种（49.38 ng/mL）、12 种（30.36 ng/mL）、6 种（25.41 ng/mL）。乙酯类化合物具有水果花香味，可减少酸奶的苦味和酸味[35]，在RTB 中含量最高，为50.73 ng/mL，这与前文RTB 中滴定酸度最低、有机酸含量最低和质构中苦味最弱结果一致。

醛类物质是酸奶中重要的风味物质。RTB、RT、RB 和TB 中出的醛为6 种（14.18 ng/mL）、4 种（10.31 ng/mL）、7 种（36.21 ng/mL）、6 种（9.85 ng/mL）。壬醛会产生蜡香、蜂蜜香等，在RT 中含量最高，为4.21 ng/mL；癸醛微甜，有类似于甜橙油和玫瑰油的味道，散发出新鲜的柑橘皮的清香味，只在RTB 中检测出。

综上，3 株菌发酵酸奶的醇、酸、脂、酮都显著高于其他2 株菌发酵的样品，对3 株菌发酵酸奶贡献性较大的是酮类、酸类，含量最大的四种物质是2-壬酮（341.94 ng/mL）、2-庚酮（111.62 ng/mL）、辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）。3 株菌发酵中的醇、酸、脂、酮等含量分布较为分散、合理，3株菌发酵提高了酸奶风味物质种类和含量，3 株菌发酵的酸奶风味更均衡。

3 结论

3 株菌协同发酵显著提高酸奶的活菌数（9.99 log cfu/mL）、咀嚼性（0.45 mj）、内聚性（0.73 Ratio）、胶黏性（0.05 N）、乙酸含量（0.79 mg/mL）、甜味和鲜味味觉响应值，显著减弱酸奶的苦味、涩味、酸味味觉响应值（p＜0.05）；3 株菌发酵酸奶的风味物质为81 种（1331.74 ng/mL），种类、含量显著高于2 株菌发酵的酸奶，且其中的醇、酸、酸、酮含量都显著高于两菌发酵的样品（p＜0.05）。3 株菌协同发酵薏米酸奶的整体凝固性较好、质构特性较好、滋味适中、风味物质种类较多和含量较高，并且酸奶具有薏米独特的谷物香味，为Lactobacillus reuteri在乳制品中的应用及薏米产品的深入研发提供理论依据。