柴胡和白芍醋炙前后组方四逆散对抑郁大鼠粪便代谢组学的比较

莫子晴，蔡皓，段煜，裴科，张雅婷，钮敏洁，王梦晴，于慧

(1.南京中医药大学药学院，国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京 210023；2.山西中医药大学制药与食品工程学院，山西 太原 030024)

抑郁症是目前全球发病率高居首位的精神类疾病，其特征是快感低下、情绪低落以及自杀率高。据保守估计，全球抑郁症患者至少已经有3.5亿[1]。四逆散最早记载于张仲景所著《伤寒论》，由柴胡、白芍、枳实、炙甘草4味药组成，具有疏肝解郁、和解表里之功效，为具有调节情志作用的经典名方，同时也是中医临床治疗抑郁的基础方。醋是中药炮制的一种重要辅料，具有引药入经、破血快、散瘀消肿的作用，被广泛应用于疏肝解郁、散瘀止痛药物的炮制。《本草蒙筌》有“用醋注肝经且资住痛”的记载[2]。柴胡和白芍醋炙后，均能增强其疏肝解郁的作用[3-4]。课题组前期研究发现，柴胡和白芍作为四逆散的君药和臣药，醋炙后组方的四逆散在抗抑郁的作用方面得到了显著提升。课题组前期还采用了UHPLC-Q-TOF/MS技术对四逆散及柴胡和白芍醋炙后组方的四逆散的化学成分进行了分析比较，并结合多元数据分析手段筛选出了12种成分为四逆散醋炙增效的潜在物质基础[3]。然而，四逆散对于抑郁症的治疗机制以及炮制增效的科学内涵仍有待进一步的深入研究。

粪便代谢物为肠道菌和宿主的共同代谢物，是能整体反映疾病条件下代谢状况的重要研究对象[5]。本课题组开展的该项研究具有双重的目的。首先，我们建立一种广泛使用的慢性不可预知温和应激(CUMS)抑郁模型，探索抑郁大鼠粪便代谢组学的变化，对前人的研究进行验证和补充。其次，我们运用1H-NMR技术从代谢角度探讨柴胡和白芍醋炙前后的组方对四逆散抗抑郁作用的影响，从粪便代谢组学的角度探究中药复方炮制增效内涵的研究报道，可为进一步深入研究抑郁症、中药炮制、肠道菌群三者的关联奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量200～250 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0004。本实验经南京中医药大学动物伦理委员会批准，批准号：ACU190801。

1.2 药物与试剂

四逆散由柴胡、白芍、枳实和炙甘草4味饮片按1∶1∶1∶1的比例组成。柴胡饮片(批号：20180601)、白芍饮片(批号：20180611)、枳实饮片(批号：20190129)和炙甘草饮片(批号：20180713)均购自安徽铜陵禾田中药饮片有限公司,每味饮片经南京中医药大学刘训红教授鉴定为正品。醋柴胡饮片及醋白芍饮片均由上述所购批号的柴胡饮片和白芍饮片按《中国药典》醋炙法中记载的炮制方法进行规范炮制。盐酸氟西汀片(批号：20190506)购自常州四药制药有限公司，氘水(D2O，批号：MKBP6567V)购自美国Sigma公司，4-二甲基-4-硅代戊磺酸钠(DSS，批号：269913)购自美国Sigma公司。

1.3 仪器

Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz全数字化超导核磁共振谱仪(YB-1B，德国Bruker公司)，Allegrax-22R多功能离心机(美国Beckman coulter公司)，BSA224S-CW万分之一天平(德国Sartorius公司)，Quintix35-1CN十万分之一天平(德国Sartorius公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 中药提取液的制备

取柴胡、白芍、枳实和炙甘草等量，加适量蒸馏水加热回流提取1 h，过滤得滤液，并对滤渣以相同煎煮及过滤步骤进行操作。合并2次滤液并置于旋转蒸发仪，浓缩得合生药量为0.96 g/mL四逆散提取液，取醋柴胡、醋白芍、枳实和炙甘草等量，同法制得醋炙品组方四逆散提取液。

2.2 CUMS模型的制备

适应性饲养1周后将大鼠随机分为5组(n=8)：空白组、模型组、四逆散组、醋炙品组方四逆散组和阳性药组。四逆散组及醋炙品组方四逆散组分别给予相应的中药复方提取液(9.6 g/kg)，空白组及模型组均给予等体积质量分数为0.9%NaCl溶液。造模开始后灌胃给药，所有药物均在应激暴露前1 h给药。将氟西汀(0.1 mg/kg)作为阳性药组。除空白组外，对所有大鼠进行CUMS程序5周。刺激方式包括噪音刺激45 min，夹尾5 min，震荡5 min，禁食24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°倾斜24 h，拥挤45 min，空瓶恐惧30 min[6]。

2.3 粪便样本的收集

造模结束后，将各组粪便样本置于离心管保存在-80 ℃冰箱中，待测。

2.4 1H-NMR代谢组学的研究

2.4.1 粪便样本处理 参考文献方法[7]，100 mg粪便加入600 μL磷酸缓冲液(0.2 mol/L Na2HPO4-0.2 mol/L NaH2PO4，pH=7.4)和200 μL D2O(含有0.05%DSS)，将匀浆液室温超声30 min后离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，取上清液500 μL至5 mm NMR核磁管中，震荡混匀。DSS作为内标参比(δ0.00)，D2O用于锁定信号。

2.4.21H-NMR测定条件 实验温度为25 ℃，粪便样本采用预饱和的1D NOESY脉冲序列压制水峰，弛豫时间为2 s，采样时间为1.64 s，谱宽为10 kHz，采集次数为128次。

2.4.31H-NMR图谱处理及统计分析 使用MestReNova软件(V12.0)对核磁谱图进行处理，线宽因子(LB)设为1 Hz，随后校正谱图的相位和基线，最后以内标DSS(δ0.00)进行定标。谱图处理后进行分段积分以应用于多变量数据统计分析，在δ0.5～9.5区按δ0.004等间隔分段积分，切除水峰(δ4.67～4.97)，积分数据使用内标进行归一化。采用SIMCA-P 13.0软件将1H-NMR采集处理的积分数据进行中心化和规格化后,进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。

3 结果

3.1 柴胡和白芍醋炙前后组方四逆散对CUMS抑郁大鼠行为学指标的影响

测试结果见表1。大鼠体质量、蔗糖偏好率以及强迫游泳时间的统计分析显示各组之间存在显著差异。与空白组比较，模型组大鼠的体质量明显下降(P<0.01)，蔗糖偏好率显著降低(P<0.01)，强迫游泳时间有明显延长(P<0.01)，说明CUMS大鼠模型复制成功。与模型组大鼠比较，服用四逆散、醋炙品组方四逆散以及阳性药的大鼠均在行为学指标上有更好的表现，表明四逆散和醋炙品组方四逆散均可缓解CUMS诱发的抑郁症状。而与四逆散比较，醋炙品组方四逆散抗抑郁的效果更佳。

表1 大鼠行为学指标结果

3.2 1H-NMR图谱的指认与分析

结合代谢物的化学位移值、峰的裂分及偶合常数、参考文献[8-10]和HMDB(http://www.hmdb.ca/)数据库对本实验所得1H-NMR图谱进行解析，共认定了32种化合物,见图1和表2。

表2 内标及大鼠粪便1H-NMR数据归属

C.空白组;M.模型组;SNS.四逆散组;VPSNS.醋炙品组方四逆散组;FLU.阳性药组

3.3 抑郁模型大鼠机体代谢表型的变化

采用OPLS-DA研究空白组和模型组的代谢图谱差异,见图2。空白组和模型组的粪便样品在PC1维上可完全区分，说明CUMS抑郁模型大鼠机体的生理及代谢状况已经发生了明显的改变。其模型质量参数：具有1个主成分和4个正交成分，R2X=0.706，R2Y=1，Q2=0.906。上述参数说明模型比较可靠。

注：C.空白组;M.模型组

3.4 与抑郁症相关的潜在生物标记物识别

采用OPLS-DA相关系数对比筛选差异代谢物。正号和负号分别表示浓度的正相关和负相关。基于在P=0.05水平上的差异显著性，相关系数r>0.5用作统计显著性的临界值[11]。在粪便样本中筛选得到17种包括苯丙氨酸、酪氨酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、甘氨酸等在内的具有显著差异的代谢物。见表3。

表3 空白组与模型组存在显著性差异的代谢物及其相关系数

3.5 四逆散及醋炙品组方四逆散对抑郁大鼠粪便代谢紊乱的干预作用及比较

如图3～4所示，给药处理的样本点与模型组样本点可以完全分离，说明四逆散、醋炙品组方四逆散以及阳性药氟西汀在发挥抗抑郁疗效的同时也实际上改变了抑郁大鼠的代谢状况，并能对抑郁大鼠的粪便代谢紊乱产生有效干预。其中四逆散干预的大鼠与醋炙品组方四逆散干预的大鼠具有不同的代谢特征。那么，柴胡和白芍醋炙后组方四逆散具有更佳的抗抑郁疗效的炮制内涵是否也隐藏其中呢？四逆散组和醋炙品组方四逆散组的OPLS-DA得分图与排序验证图以及相关系数负载图如图5所示。其模型质量参数具有1个主成分和1个正交成分，R2X=0.646，R2Y=1，Q2=0.977。所有数学模型的Q2均较高，说明所有模型均比较可靠。OPLS-DA的相关系数负载图已直观地展示出两组之间存在显著性差异的代谢物。根据结果，一共筛选出乳酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、甲酸、乙酸、苏氨酸6种潜在的差异代谢标志物，见表4、图6。

注：M.模型组;SNS.四逆散组

注：M.模型组;VPSNS.醋炙品组方四逆散组

注：SNS.四逆散组;VPSNS.醋炙品组方四逆散组

表4 四逆散组和醋炙品组方四逆散组存在显著性差异的代谢物及其相关系数

C.空白组;M.模型组;SNS.四逆散组;VPSNS.醋炙品组方四逆散组;FLU.阳性药组

3.6 代谢通路归属分析

将上述筛选得到的差异代谢物导入到Metabo Analyst4.0数据库中进行代谢通路分析。与空白组大鼠比较，抑郁大鼠共有包括苯丙氨酸代谢、酪氨酸以及色氨酸生物合成代谢、丙氨酸和天门冬氨酸以及谷氨酸代谢、氮代谢、谷胱甘肽代谢、卟啉和叶绿素代谢等28条通路发生变化。与给予四逆散的抑郁大鼠比较，给予醋炙品组方四逆散的抑郁大鼠共有包括丙酮酸代谢、糖酵解和糖质新生代谢、甲烷代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、甘氨酸和丝氨酸以及苏氨酸代谢、氨酰合成代谢的6条通路发生变化。2项代谢通路的分析结果均以气泡图的形式进行展示，见图7。

图7 与CUMS抑郁模型大鼠相关的代谢通路以及与四逆散醋炙增效相关的代谢通路

4 讨论

现代药理和临床研究均已证明了四逆散对抑郁症的治疗作用[12-13]，然而对于复方中的单味药是以生品还是炮制品配伍组方仍缺乏足够的科学解释，这直接导致临床复方中炮制品使用的混乱。因此，开展中药炮制配伍组方机制的研究对中医临床合理用药具有十分重要的意义。本课题组前期已在化学物质、单胺类神经递质以及分子机制等方面进行了探索，本次实验研究的重点是从粪便代谢组学的角度讨论醋炙的增效内涵。

苯丙氨酸和酪氨酸都是动物以及人体内不能自行合成的必需氨基酸，也是与单胺类神经递质分泌紧密相关的2种物质。苯丙氨酸能转化为酪氨酸，而酪氨酸代谢与抑郁症的病发和进展有着密切的关联[14]。酪氨酸是多巴胺(DA)合成的前体，而DA是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，具有产生愉悦感以及调控中枢神经系统多项生理功能的作用[15]。DA是合成去甲肾上腺素(NE)的前体。NE与神经活动、行为以及睡眠节律等调节均有关系[16]。在本实验中，与空白组比较，模型组大鼠体内的苯丙氨酸和酪氨酸水平较低，这也从代谢的角度部分解释了抑郁大鼠体内单胺类神经递质的水平往往偏低的情况，与前人关于抑郁症代谢组学的相关研究结果[17]一致，再次验证了抑郁症与单胺类神经递质的密切联系。

尿嘧啶是抑郁症研究领域文献报道较少的代谢物。研究显示尿嘧啶能明显抑制单胺氧化酶(MAO)的活性，而MAO抑制剂是重要的抗抑郁药物之一[18]。本实验研究结果与其他代谢组学相关文献结论一致[17]，再次提示了尿嘧啶与抑郁症发病的潜在联系。

乳酸是丙酮酸代谢通路中的重要代谢物，也是机体内糖酵解的最终产物[19]。研究表明，血浆乳酸含量的变化与细胞厌氧呼吸相关[20]，这是一种能量代谢过程，提示抑郁大鼠能量代谢紊乱。α-葡萄糖和β-葡萄糖皆属于糖代谢过程中的重要物质。葡萄糖的生理功能主要是为机体提供能量来源，通过糖异生途径合成，其主要代谢途径是糖酵解和糖异生。重度抑郁症患者患2型糖尿病的几率明显上升，而抑郁情绪影响体内糖代谢，使机体对糖代谢调节能力降低[21]。研究表明抑郁症患者存在体内能量代谢紊乱现象[22]。此外，α-葡萄糖还是肠道产生短链脂肪酸(SCFA)有益菌的主要来源[11]。与四逆散组大鼠比较，醋炙品组方四逆散组大鼠粪便乳酸以及葡萄糖的含量波动明显，说明柴胡和白芍醋炙后组方能改善四逆散对于抑郁状态下大鼠能量代谢和相关物质代谢紊乱。

SCFA也称挥发性脂肪酸，主要是由肠道益生菌发酵膳食纤维和部分氨基酸及蛋白质的终产物。SCFA对机体有着极其重要的意义，具有为细胞提供能量、抑制致病菌、抑制部分细胞的炎症反应、调节机体平衡代谢等作用[23]。同时，SCFA还与肠道菌群的代谢高度相关，这些SCFA在人体体液中的含量能反映人体内肠道菌群的代谢情况[24]。乙酸是SCFA中含量最为丰富的品种之一，肠腔内产生的乙酸有一部分被运输至肝脏参与合成长链脂肪酸和谷氨酸等[25]。针对实验结果，我们从肠道菌群代谢的角度初步推测：模型组大鼠与空白组大鼠的粪便代谢差异物有乙酸，提示抑郁症可能会影响乙酸代谢进而对肠道菌群功能及其代谢产生影响。与四逆散组大鼠比较，醋炙品组方四逆散组大鼠的粪便中乙酸含量变化显著，提示柴胡和白芍醋炙后组方的四逆散在肠道菌群功能及其代谢方面参与调控的可能性。但这是内源性变化还是外源性变化所引起，抑或是综合导致的结果？本课题组将在今后采用更合适的分析检测手段开展进一步的相关研究。

无论是乳酸，还是α-葡萄糖、β-葡萄糖、SCFA，这些差异代谢物均提示了醋炙与抑郁症以及能量代谢稳态之间的相互联系。代谢组学的优势在于可以提供有关微生物功能最终产物的信息，而粪便样品的代谢组学可以为肠道微生物的代谢提供更加清晰的线索。本课题组目前正在进行的醋炙对肠道菌群在抑郁症领域影响的研究也将进一步解释这方面的疑问。

有研究发现，苏氨酸在难治性抑郁患者血清中有明显的变化[26]。苏氨酸是人体必需氨基酸，同时也是动物的第二或第三限制性氨基酸，能促进免疫球蛋白和淋巴细胞的合成，其含量降低会抑制免疫球蛋白和T淋巴细胞生成，进而影响免疫功能[27]。苏氨酸也是生酮氨基酸，与氨基酸代谢障碍之间具有密切的联系，临床和动物实验表明，氨基酸参与的代谢与多种疾病的发生和发展有关，但与抑郁症相关的报道主要集中在与色氨酸的相关性上[28]，抑郁症与其他氨基酸的内在联系还有待进一步研究。同时苏氨酸是甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢的重要一环，该条代谢途径可为三羧酸循环所需能量提供重要的代谢前体[29]。这与前面关于柴胡和白芍醋炙后组方也许能改善四逆散对于抑郁状态下的能量代谢和相关物质代谢紊乱调控的结论相一致。

综上所述，与四逆散原方比较，柴胡和白芍醋炙后组方的四逆散能协同调控包括丙酮酸代谢、糖酵解与糖质新生代谢、甲烷代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、氨酰合成代谢在内的6条代谢通路。结合筛选出的与醋炙增效相关的6种潜在代谢标志物，我们可以综合分析得出：醋炙品组方四逆散在抗抑郁方面的增效作用可能与能量代谢、氨基酸代谢、免疫调控以及肠道菌群有关。本研究从内源性代谢物的角度为探索中药炮制醋炙增效的作用机制提供了一定的依据，更进一步的内在联系以及相关代谢通路的验证仍需更加深入的考察。