山海丹颗粒对勃起功能障碍模型大鼠的疗效及相关作用机制研究

杨春媚，戴小斌，郑维维，钱程，刘洋，杨葛俊，郑孟凯，陆茵，王爱云

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023；3.浙江施强制药有限公司，浙江 杭州 311508)

勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)指阴茎不能持续达到或维持足以进行性行为的勃起状态，是男性泌尿科常见的疾病之一，涉及血管内皮细胞、平滑肌、心肌、神经和激素系统的综合同步作用[1-2]。目前，临床用于治疗ED的常用药物包括PDE5抑制剂和中成药等。PDE5抑制剂通过竞争性抑制磷酸二酯酶，抑制cGMP水解，松弛平滑肌，使血液流入阴茎组织，刺激机体产生勃起[3]。但长期使用PDE5抑制剂会引起一系列的不良反应，尤其会对心血管造成严重损伤[4]。

ED属于中医学精浊和阳痿范畴，其主要病理特点是肝郁，并且具有一定普遍性。发病的主要病理趋势是肾虚，发病的最终病理趋势是血瘀[5]。因此，中医对ED的论治以肝、肾为中心，以疏肝、益肾、活血为基本治法。男科临床上常用的活血化瘀药有红花、丹参、三七、川芎等，皆入肝经，以疏通宗筋之血脉。

山海丹颗粒作为活血化瘀类中成药，全方由丹参、决明子、葛根、山羊血、麦冬、灵芝、人参、佛手、黄芪、红花、香附、蒲黄、海藻、何首乌、川芎、三七16味药材组成，具有活血化瘀、通脉止痛、降低血脂的功效。临床研究显示，山海丹颗粒可以改善ED患者的内皮功能，和复方玄驹胶囊联用能治疗高血脂症患者的勃起功能障碍[6]。前期课题组采用网络药理学对山海丹颗粒活性成分和疾病靶点进行整合筛选，初步发现山海丹颗粒可能通过凋亡途径和靶向NOS等关键蛋白来发挥治疗ED的作用[7]。据此，在本研究中，我们进一步探索了山海丹颗粒对ED的改善作用和相关机制，以期为山海丹颗粒的临床应用和ED疾病治疗提供一定的理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康Wistar大鼠，体质量250～300 g，140只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号:SCXK(京)2016-0006，实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2014-0001。涉及的动物实验遵循南京中医药大学实验动物伦理委员会规定章程，动物伦理批号：202101A038。

1.2 药品和试剂

山海丹颗粒(浙江施强制药有限公司，批号：20190402)；西地那非(广州白云山医药集团股份有限公司，国药准字：H20143255，批号：1190004)；疏肝益阳胶囊(贵州益佰制药股份有限公司，国药准字：Z20110030，批号：180818)；盐酸阿朴吗啡(APO)(中国食品药品检定研究院，批号：100839-201502)。一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(金益柏，批号：DWSJH)；抗荧光淬灭封片液(Beyotime，批号：P0126)。RIPA裂解液(南京化学试剂有限公司，批号：080960574)；BCA试剂盒(Thermo Scientific，批号：MJ164047)；ECL试剂盒(Millipore,批号：17104B4)；nNOS抗体(博奥森，批号：AH06118332)；iNOS抗体(博奥森，批号：AI10161987)；eNOS抗体(博奥森，批号：AI11186519)；p38抗体(Cell Signaling Technology，批号：8690S)；p-p38抗体(Cell Signaling Technology，批号：4511S)；GAPDH(BIOWORLD公司，批号：AA55151)。PCR引物序列(上海生工生物合成有限公司)。

1.3 仪器

小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：R540)；石蜡包埋仪(LEICA公司，型号：EG1150c)；石蜡切片机(LEICA公司，型号：RM2245)；蔡司倒置显微镜(ZEISS公司，型号：Discovery V20)；多孔离心机(Beckman公司，型号：Allegra X30-R)；电泳仪(BIO-RAD公司，型号：Mini Protean 3 Cell)；凝胶成像系统(BIO-RAD公司，型号：ChemiDocTMXRS+)；酶标仪(BioTek公司，型号：270133)；梯度PCR仪(Thermo Fisher Scientific公司，型号：Applied Biosystems Life Veriti96)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司，型号：iQ5)。

2 方法

2.1 动物造模和给药

将3月龄雄性大鼠适应性饲养7 d后，经交配实验确认有正常的勃起和性功能，再随机分为正常组、模型组、西地那非组、疏肝益阳胶囊组、山海丹颗粒低剂量组、山海丹颗粒中剂量组、山海丹颗粒高剂量组，每组10只。除正常组外，其余组均选用双侧髂内动脉结扎法建立血管性勃起障碍模型，即使用异氟烷呼吸机将大鼠麻醉，从腹部切开皮肤，暴露股动脉，沿股动脉小心分离至髂内动脉，使用8-0结线扎双侧髂内动脉。正常组只暴露血管不结扎。术后观察2周，选取无感染并发症大鼠。之后对大鼠进行APO检测实验，将APO按100 μg/kg注射于大鼠颈项皮肤松软处，记录30 min内勃起次数，以阴茎头充血、阴茎体增长、末端阴茎体出现算勃起1次，勃起次数不多于1次算作造模成功。

山海丹颗粒和西地那非临用前用双蒸水溶解；疏肝益阳胶囊称取适量细粉用双蒸水配置成一定浓度的混悬液。所有药物现配现用。灌胃给药持续8周，灌胃体积为每100 g给药1.2 mL。按照临床剂量换算，分别给大鼠西地那非0.010 5 g/(kg·d),疏肝益阳胶囊0.315 g/(kg·d)。山海丹颗粒低剂量组3.15 g/(kg·d)，山海丹颗粒中剂量组6.30 g/(kg·d)，山海丹颗粒高剂量组12.60 g/(kg·d)，其中以临床给药换算剂量作为低剂量。正常组和模型组均给予等体积双蒸水。

2.2 大鼠交配实验测定性行为学指标

观察时选择安静、灯光昏暗的房间，从夜间7点开始，每只雄鼠放入观察笼后，适应环境10 min，随后放入1只雌鼠与之同笼，并开始计时20 min，记录20 min内的扑捉潜伏期和射精潜伏期。扑捉潜伏期指自雌鼠投入至雄鼠第一次扑捉雌鼠的时间；射精潜伏期指自雌鼠投入至雄鼠第一次射精时间。

2.3 体质量和脏器指数检测

每周记录各组大鼠的体质量。末次给药结束后，注射过量空气处死大鼠，取各组大鼠的肝、肾、前列腺、阴茎和睾丸，称质量。脏器指数=脏器质量/体质量×100%。

2.4 TUNEL染色检测睾丸组织内细胞凋亡情况

8周给药结束后，收集大鼠睾丸，PBS冲洗后放入4%多聚甲醛固定过夜，经包埋和切片等处理后，制得5 μm石蜡切片。按常规方法进行脱蜡，60 ℃烘片60 min，1×PBS漂洗3次，每次5 min。每个组织切片上滴加100 μL Proteinase K工作液(PBS稀释)，37 ℃反应30 min，1×PBS漂洗3次。在1张样本片上滴加100 μL DNaseⅠ反应液，37 ℃处理30 min，1×PBS漂洗。样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50 μL TdT酶反应液，放入温盒中，37 ℃避光反应60 min，PBS漂洗3次。每个样本上滴加50 μL Streptavidin-TRITC标记液(5 μL Streptavidin-TRITC+45 μL Labeling buffer)，放入湿盒，37 ℃避光反应30 min，PBS避光漂洗3次。DAPI染色液复染细胞核，室温避光反应10 min。洗去DAPI染色液后，加适量抗淬灭封片液。荧光显微镜检测(激发波长543 nm，发射波长571 nm)。

2.5 Western blot检测阴茎组织关键蛋白的表达

基于网络药理学分析，前期找出中药复方山海丹颗粒的主要活性成分及治疗ED的潜在作用靶点为nNOS、iNOS、eNOS、p38蛋白等。取冷冻阴茎组织约0.1 g，加入800 μL蛋白裂解液(RIPA裂解液+1%PMSF)提取蛋白，经过BCA试剂盒测定浓度后，用1×Loading buffer稀释样品，100 ℃加热10 min进行蛋白变性，室温冷却后-20 ℃保存。经SDS-PAGE电泳和湿转法将蛋白转至PVDF膜上，用封闭液(5%脱脂奶粉/TBST)室温封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗脱5 min×4次后，加二抗室温孵育1.5 h，再洗脱4次，经ECL试剂盒显影，用凝胶成像系统拍照。以GAPDH为内参，用Image J软件定量分析nNOS、iNOS、eNOS、p38和p-p38蛋白条带。

2.6 qPCR检测关键蛋白mRNA水平

取冷冻大鼠的阴茎组织，匀浆后，加入TRIzol Regent裂解液，轻轻吹打均匀，于冰上静置5 min。将裂解的反应液转移至新EP管中，加入200 μL氯仿，常温静置孵育5 min。离心后转移上层溶液，每孔加入等量异丙醇，混匀后常温孵育10 min，离心弃上清。加入由DEPC水配置的75%乙醇，离心弃上清，通风处静置挥干。加入50 μL DEPC水，置于55 ℃烘箱中孵育10 min，轻轻吹打均匀，用BioTek酶标仪在260 nm/280 nm处进行纯度检测。将样品稀释至500 ng/μL，取1 μL mRNA至微量EP管中，加入11 μL RNase free ddH2O和4 μL 4×gDNA wiper mix，混匀后42 ℃水浴2 min。每管加入4 μL 5×Hiscript qRT Super mix，充分混匀后经梯度PCR仪合成cDNA。在96孔板中依次加入10 μL Super mix,2 μL cDNA,0.4 μL Forward primer,0.4 μL Reverse primer,7.2 μL的RNase free ddH2O，轻轻吹打混匀，用荧光定量PCR仪进行扩增得到各cDNA的Ct，通过2-ΔΔCt计算mRNA相对变化。引物序列如下：β-actin上游5'-ATCGTGGGGCCGCCCCTAGGC-3'，下游5'-TGGCCTTAGGGTTCAGAGG-3'；nNOS上游5'-TCAAAGCCATCCAGCGCATA-3'，下游5'-GCGGTTGGTCACTTCATACGTTC-3'；iNOS上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游5'-GGGTCTTCGGGCTTCAGGTTA-3'；p38上游5'-CCGTTTCAGTCCTTGTTGGG-3'，下游5'-TCATTTCGTCATCAGTGTGC-3'。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 山海丹颗粒对ED模型大鼠性行为的影响

APO实验检测发现，与正常组相比，造模动物30 min内勃起次数显著减少(P<0.01)，勃起次数均不多于1次，提示造模成功(表1)。

表1 APO实验检测大鼠勃起次数

3.1.1 大鼠体质量和脏器指数的变化情况 与正常组相比，模型组大鼠体质量没有明显变化，但前列腺脏器指数有显著改变(P<0.01)；与模型组比，西地那非组,疏肝益阳胶囊组,山海丹颗粒低、中、高剂量组体质量均有降低趋势，但各组大鼠体质量和脏器指数均无显著性差异；和疏肝益阳组相比，山海丹各剂量给药组对大鼠体质量和脏器指数均无显著差异(图1～2)。

图1 山海丹颗粒对ED大鼠体质量的影响

注：与正常组比较，。

3.1.2 山海丹颗粒对ED模型大鼠扑捉潜伏期的影响 同模型组相比，在给药1～8周间，西地那非组大鼠的扑捉潜伏期时间显著缩短(P<0.01)；从给药第2周起，疏肝益阳胶囊组大鼠的扑捉潜伏期时间显著缩短(P<0.05～0.01)；同时，从给药第3周起，山海丹颗粒高剂量组大鼠扑捉潜伏期显著缩短(P<0.05～0.01)；而山海丹颗粒低、中剂量组大鼠扑捉潜伏期在给药4～8周间，才出现显著缩短的情况(P<0.05～0.01)。提示山海丹颗粒的药效与剂量呈正相关。与疏肝益阳胶囊相比，山海丹颗粒中、高剂量对ED模型大鼠扑捉潜伏期的影响相当；而低剂量组效果显著不如疏肝益阳组(P<0.05～0.01)(表2)。

表2 山海丹颗粒对ED大鼠扑捉潜伏期的影响

3.1.3 山海丹颗粒对ED模型大鼠射精潜伏期的影响 同模型组相比，给药1～8周间，西地那非组大鼠的射精潜伏期显著缩短(P<0.05～0.01)；从给药第5周起，疏肝益阳胶囊组大鼠的射精潜伏期显著缩短(P<0.05～0.01)；在给药3～8周间，山海丹颗粒高剂量组大鼠的射精潜伏期显著缩短(P<0.05～0.01)；在给药第6～8周时，山海丹颗粒中剂量组大鼠的射精潜伏期显著缩短(P<0.05～0.01)；给药第7周起，山海丹颗粒低剂量组大鼠的射精潜伏期显著缩短(P<0.05)。提示山海丹颗粒的药效与剂量呈正相关。与疏肝益阳胶囊相比，山海丹颗粒各给药剂量组对ED模型大鼠射精潜伏期的影响无显著差异，说明山海丹颗粒缩短射精潜伏期的效果与疏肝益阳胶囊相当(表3)。

表3 山海丹颗粒对ED大鼠射精潜伏期的影响

3.2 山海丹颗粒对大鼠睾丸组织内细胞凋亡的影响

TUNEL染色的正常细胞胞核为蓝色，阳性凋亡细胞胞核呈红色。荧光图显示(图3)，在各组大鼠睾丸组织切片中均可观察到红色的凋亡细胞，背景清晰。与正常组比较，模型组TUNEL阳性的凋亡细胞比例显著上升(P<0.01)；和模型组相比，各给药组TUNEL阳性细胞占比显著增多(P<0.05～0.01)；山海丹颗粒治疗组呈浓度依赖性地降低凋亡生精细胞数，且和疏肝益阳组相比，山海丹颗粒治疗组无显著差异，表明山海丹颗粒抑制生精细胞凋亡的作用效果与疏肝益阳胶囊相当。

注：A.正常组；B.模型组；C.西地那非组；D.疏肝益阳胶囊组；E.山海丹颗粒低剂量组；F.山海丹颗粒中剂量组；G.山海丹颗粒高剂量组;与正常组比较，。

3.3 山海丹颗粒对阴茎组织关键蛋白NOS和p38表达的影响

Western blot结果表明(图4)，与正常组相比，模型组大鼠阴茎组织nNOS、iNOS和eNOS蛋白表达显著减少(P<0.05～0.01)，p-p38蛋白表达显著增多(P<0.05)。与模型组相比，山海丹颗粒低剂量组可以显著增加nNOS蛋白表达(P<0.01)；山海丹颗粒中剂量组可以显著增加nNOS和eNOS蛋白表达(P<0.05～0.01)；山海丹颗粒高剂量组可以显著增加nNOS、iNOS和eNOS蛋白表达(P<0.05～0.01)。另外，山海丹颗粒自低剂量起就能明显降低p-p38/p38比例(P<0.05)。提示山海丹颗粒可能通过调控iNOS、eNOS和nNOS蛋白表达及p38蛋白磷酸化，发挥治疗ED的作用。

注：A.正常组；B.模型组；C.山海丹颗粒低剂量组；D.山海丹颗粒中剂量组；E.山海丹颗粒高剂量组;与正常组比较,。

3.4 山海丹颗粒对阴茎组织关键蛋白mRNA水平的影响

结果见图5。与正常组相比，模型组大鼠阴茎组织nNOS、iNOS和eNOS mRNA表达显著减少(P<0.01)，p38 mRNA表达显著增多(P<0.01)。与模型组相比，山海丹颗粒低、中剂量组可以显著下调p38 mRNA表达水平(P<0.01)；山海丹颗粒高剂量组可以显著上调nNOS、eNOS和iNOS的mRNA水平(P<0.05～0.01)，显著降低p38 mRNA表达水平(P<0.01)。山海丹颗粒可能通过影响nNOS、eNOS、iNOS和p38的mRNA水平，从而发挥对ED的治疗作用。

注：与正常组比较,。

4 讨论

ED是一种常见的男科疾病，PDE5抑制剂是ED的一线治疗药物，但其有效率仅为60%～70%，且常见心血管损伤等不良反应[8]。因此，寻找各种替代疗法或补充疗法来提高治疗ED药物的疗效成为当务之急。肾和肝是与ED相关的2个主要器官。肾藏精，肝藏血，肾和肝负责机体的生长、发展和繁殖[9]。山海丹颗粒能入心散血中之滞，入肝理血之壅，具有疏肝理气，益气养血，滋阴复脉的功效。在本研究中，我们采用经典的双侧髂内动脉结扎的方法，建立血管性ED大鼠模型。实验结果显示，山海丹颗粒能浓度依赖性地缩短扑捉潜伏期和射精潜伏期，且只改变大鼠前列腺脏器指数(P<0.01)，对大鼠的体质量和其他脏器无影响。提示山海丹颗粒可能是一种治疗ED比较有效安全的中成药。

ED的发生发展常伴随着睾丸组织内的细胞凋亡。睾丸组织结构发生病变导致生精细胞大量凋亡，精子严重减少。本研究对ED大鼠睾丸进行TUNEL染色，发现山海丹颗粒中、高剂量组能够显著降低睾丸组织中生精细胞的凋亡数(P<0.05～0.01)，但是其影响组织内细胞凋亡的具体机制还需要进一步探索。

现代医学研究表明，NO在勃起功能中起关键作用，可用于ED的治疗[10]。NO由iNOS、eNOS、nNOS三种不同类型的酶产生。NOS催化人体内L-精氨酸产生NO，NO扩散至阴茎海绵体平滑肌细胞内，催化生成cAMP和cGMP，磷酸化某些蛋白质和离子通道，导致阴茎海绵体内小动脉及血管平滑肌细胞舒张，海绵体血流量增多，从而引起阴茎勃起[11-12]。此外，p38丝裂原活化蛋白激酶可增强精氨酸酶活性，引起内皮细胞功能异常，激活p38/MAPK通路可提高精氨酸酶在内皮细胞中的表达[13]，与ED的发生发展密切相关。在本研究中，我们对大鼠阴茎组织的关键蛋白NOS和p38及其mRNA水平进行检测，发现山海丹颗粒能够上调iNOS、eNOS、nNOS和p38的表达，同时抑制p38蛋白磷酸化，这与课题组先前的网络药理学结果相一致，证实山海丹颗粒能通过调控iNOS、eNOS、nNOS和p38，发挥治疗ED的作用。

综上所述，山海丹颗粒可有效改善ED模型大鼠的疾病状态，对ED的治疗作用机制可能部分是通过调控iNOS、eNOS、nNOS和p38来实现的，这为山海丹颗粒应用于临床治疗ED提供了科学可靠的依据。