电针对脑缺血再灌注大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达的影响

徐疏影，李文倩，洪浩，蔡云，吴旭，朱冰梅，彭拥军

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.四川大学华西医院，四川 成都 610041；3.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院，江苏 南京 210023)

脑缺血是由大脑局部供血不足引起，继发各种病理生理变化的一种常见神经系统疾病，具有高发生率、高致残率及高死亡率的特点，严重危害患者的健康及生活质量[1-2]。脑缺血再灌注损伤是指脑血流中断后再次灌流至脑缺血半暗区，在挽救濒死神经细胞的同时，对其产生迅速的级联反应损伤，最终导致神经细胞的凋亡或坏死，进一步加重脑组织损伤[3-4]。有研究证明，在再灌注阶段，细胞自噬参与调控了神经细胞的损伤与凋亡[5]。针灸被广泛用于干预脑缺血的发生发展期[6],然其治疗机制尚不明确。因此本研究拟通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，探讨电针对大鼠神经细胞的保护作用与细胞自噬的关联性，以期探究电针的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量250～280 g，共72只(重庆威斯腾生物科技有限公司)。动物自购回后保持动物房12 h/12 h昼夜交替，保持动物自由饮水、进食，温度23～25 ℃，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 TTC溶液(Sigma公司，美国)；苏木素染液(南京建成生物工程研究所)；伊红染液(上海碧云天生物公司)；LC3-Ⅱ、Beclin1兔来源单抗(Abcam，英国)；山羊抗兔IgG二抗(Sigma，美国)；G6805-Ⅱ型电针治疗仪(上海医疗电子仪器有限公司)；RNA提取试剂盒(Takara，日本)；Tanon-1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；倒置显微镜(Olympus，日本)；照相系统(Olympus，日本)；PTC-100 PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 将72只大鼠采用随机数字法分为对照组、模型组和电针组，每组24只。对照组大鼠不作任何处理。参照Longa线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉(MCA)，建立改良的急性局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO)[7]。大鼠称质量，7%水合氯醛(每100 g体质量给予0.5 mL)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位放置于操作台上，钝性分离右侧皮下组织及肌肉，暴露出颈总动脉，眼科镊小心分离伴行于颈总动脉的迷走神经及动脉周围黏膜组织，可见颈外动脉、颈内动脉与颈总动脉呈“Y”字形分布。颈外动脉远心端结扎，近心端埋线以备结扎拴线，再用微动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端，用显微外科剪将颈外动脉剪一小口，将栓线由颈外动脉切口处插入颈内动脉，松开微动脉夹，将栓线送入颅内，进入18～20 mm时有明显的阻力感，表明栓线已插入大脑中动脉，MCAO即告成功。

插线成功即为脑缺血开始，1 h后，将栓线轻柔退至颈外动脉处，即为再灌注开始。术后动态观察大鼠的反应。麻醉后保温至动物苏醒，肛温(36.5±0.5)℃。

1.2.2 电针治疗方法 电针组在造模成功后5 min和16 h(模拟大鼠脑缺血再灌注急性期损伤的2个时间点)进行电针干预，穴位皮肤常规用75%酒精消毒后，用华佗牌0.25 mm×15 mm毫针，针刺大鼠的人中(Du26)和百会(Du20)穴。穴位定位参照《实验针灸学》[8],人中穴在大鼠唇正中裂，鼻尖下1 mm，向上斜刺1 mm。百会穴在头顶骨正中，平刺4 mm。并给予电针治疗，接G6805-Ⅱ型电针治疗仪，电针人中、百会，电流强度以大鼠胡须微微颤动为标准，采用疏密波，疏波频率3.85 Hz，持续1.28 s；密波频率6.25 Hz，持续2.08 s，电针30 min。大鼠固定方法：以110～120 cm长的棉线绳2根，6 cm宽口径的透明胶带，20 cm长、1 cm宽的丝带为材料，对大鼠进行“X”型固定操作[9]。对照组与模型组不针刺，但在针灸组进行针灸时，均行统一固定操作。

1.2.3 大鼠神经功能缺损评分 参照改良的Zea Longa 8级(0～7分)神经功能缺损评分法对大鼠进行评分[7]。大鼠无任何不对称活动为0分；提起尾巴时左前爪不能完全伸展为1分；在1分的基础上左前肢活动障碍为2分；左前肢紧贴胸壁为3分；大鼠自由活动时向左侧转弯为4分；伴有明显的左前爪后推动作为5分；只能围绕原点旋转为6分；左侧肢体完全不能支撑身体，只能躺向左侧为7分。

1.2.4 TTC染色观察大鼠脑梗死面积 于再灌注后24 h快速断头取材，-80 ℃冷冻5 min，待大脑冻硬后用特制刀具将大脑等分切成2 mm厚脑片(去小脑，整脑可切5～6片)，浸入37 ℃ 2%TTC溶液中孵育15 min。待TTC染色完成后将脑片浸入4%中性多聚甲醛固定保存，拍照，扫描，用Ulead photo Express2.0图像分析软件进行脑梗死轮廓勾画，用法医损伤测量软件测量梗死组织面积。

1.2.5 HE染色观察大鼠脑组织病理学变化 于再灌注后24 h快速断头取材，取脑组织后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，根据大鼠解剖图谱选取纹状体显示明显区域的脑切片，并制备石蜡切片；常规乙醇、二甲苯脱水；将组织浸泡于石蜡中包埋，切片、烤片；石蜡切片脱蜡复水后，苏木精染色10 min，流水冲洗；伊红染色复染3 min，中性树脂封片,显微镜下观察切片。

1.2.6 Western blot检测大鼠脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达 采用Western blot检测大鼠右侧纹状体脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量，RIPA裂解液裂解组织，玻璃匀浆器匀浆，离心后提取上清，提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；配制工作液，等量蛋白样品(每孔10 μL)上样，酶标仪波长设定在562 nm处进行测定；电泳后将目的蛋白转膜至PVDF膜上，TBST清洗；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗1∶1 000稀释后室温孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min；二抗1∶1 000稀释后室温孵育1.5 h，TBST清洗4次，每次5 min，将ECL曝光液按A液∶B液为1∶1混匀后，均匀覆盖在整片膜上，反应2 min放入曝光仪曝光检测，以GAPDH为内参进行灰度值比较。

1.2.7 qPCR检测大鼠右侧纹状体脑组织Beclin1 mRNA表达 于再灌注后24 h快速断头取材，取新鲜脑组织，根据RNA提取试剂盒说明书提取RNA，参照逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qPCR，反应体系为：2×SYBR Mix 5 μL，引物各0.5 μL，10×cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL。反应参数设置为:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。引物序列见下表1。以GAPDH作为内参基因,根据2-ΔΔCt法计算Beclin1 mRNA的相对表达量。

表1 qPCR引物序列

2 结果

2.1 电针对MCAO大鼠神经功能评分的影响

对照组无行为学改变，模型组神经功能评分显著高于对照组，而与模型组比较，电针组的神经功能缺损评分显著降低(P<0.01)。见图1。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，

2.2 TTC染色观察电针对3组大鼠脑梗死体积

对各组大鼠进行TTC染色检测脑组织梗死体积，红色为正常脑组织，苍白色为梗死灶；对照组无肉眼可见梗死组织；与对照组比较，模型组梗死体积百分比显著升高(P<0.01),而电针干预可显著减少梗死体积(P<0.01)。见图2～3。

图2 3组大鼠脑梗死TTC染色图

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，

2.3 HE染色观察电针对3组大鼠脑组织病理学影响

图4显示，与对照组比较，模型组大鼠大脑组织疏松水肿，神经细胞萎缩、数量明显较少，细胞核固缩，呈空泡状；电针组大鼠神经细胞数量也有减少，少部分细胞架构不完整，出现固缩现象，但相对模型组神经元损伤减轻，神经元细胞明显较多。

图4 3组大鼠脑组织HE染色图

2.4 电针对MCAO大鼠右侧纹状体脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达影响

图5结果显示，与对照组比较，模型组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表达明显上升(P<0.01～0.05)，电针可使LC3-Ⅱ、Beclin1表达显著上升(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，

2.5 电针对MCAO大鼠右侧纹状体脑组织中Beclin1 mRNA表达影响

图6的qPCR结果显示，与对照组比较，模型组Beclin1 mRNA表达无显著增加；与模型组比较，电针组Beclin1 mRNA表达显著增加(P<0.01)。

注：组间比较，

3 讨论

急性脑缺血在中医学中属“中风”范畴，病因病机多为脑脉痹阻、脑髓失养等，而人中穴为督脉所属穴，可调督脉之经气，针感强烈，可醒神开窍、调和阴阳、镇静安神、解痉通脉，是治疗急性脑缺血的经验要穴[10]。百会穴居颠顶，与脑联系甚密，通达阴阳脉络，连贯周身经穴，针刺百会可开窍醒脑,调理髓海。两穴均是急性脑卒中临床经验要穴，合用可调节气血，疏通脑络。针灸作为祖国传统医学中的非药物疗法，其治疗脑卒中的疗效已被广泛认可。

查天柱等[11]通过临床实验发现针刺能显著改善缺血性脑卒中患者凝血功能，增加脑血流量，以促进神经细胞修复及干细胞增殖，加快神经损伤修复。而关于针刺防治脑缺血再灌注损伤的机制研究目前还在不断深入，已有实验发现细胞自噬参与针刺抑制脑缺血再灌注损伤的过程[10，12]。然而，针灸是通过抑制还是促进细胞自噬改善脑缺血再灌注损伤目前尚无定论。黄亚光等[13]发现与模型组相比，电针可显著减少自噬小体与皮层缺血区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值等，因此猜想电针预处理可能通过抑制自噬改善脑缺血再灌注损伤。而刘昊等[14]通过动物实验发现，针刺可显著改善大鼠神经功能缺损，且与模型组相比，针刺组大鼠脑组织中LC3蛋白呈阳性表达，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高，同时，针刺诱发的自噬水平较雷帕霉素组低，说明针刺可适度激活脑出血后自噬的水平，从而改善大鼠脑损伤程度。而本研究实验结果提示，电针不仅显著降低了脑缺血再灌注后神经功能缺损评分，降低脑梗死体积，且可上调自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白与Beclin1 mRNA的表达，促进细胞自噬以加速神经元损伤的恢复，缓解再灌注损伤。

细胞自噬参与人类许多重要的生理病理过程[15]，如细胞生长、存活和分化的各阶段，在抗癌、抗衰老和神经保护等方面具有不同的作用[16]。本研究结果发现，与对照组比较，模型组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1显著上调，Beclin1 mRNA表达也显著升高，说明自噬在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。LC3的形成来源于前体LC3通过蛋白水解或自噬体LC3-磷脂酰乙醇胺(PE)去离子化。在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下，将LC3前体加工成可溶性LC3-Ⅰ，其与PE的作用下Atg7和Atg3形成的脂溶性LC3-Ⅱ-PE相关联，与机体细胞膜的延伸直至自噬溶酶体形成相关[17-18]。LC3-Ⅱ是与自噬体相关的唯一可靠的标记蛋白，其同时也存在于吞噬体。Beclin1在自噬的起始过程中起着重要的作用，主要通过与PI3K和Atg14形成三聚体，并持续招募自噬相关蛋白介导自噬的启动[19-20]。Beclin1作为自噬过程中不可缺少的调节因子，通过调节Ⅲ类PI3K依赖性的3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)的产生以及随后补充ATG蛋白促进自噬体的形成，在自噬过程中起主导作用[21-23]。因此，LC3-Ⅱ与Beclin1是检测自噬水平的2种关键生物标志物。

综上，通过电针MCAO大鼠人中、百会穴影响脑缺血再灌注损伤的研究，可知细胞自噬参与调控脑缺血后神经细胞的代谢与凋亡过程，且从细胞自噬的角度提示了电针预防脑卒中的保护机制，并证明了针刺治疗脑血管等疾病多方位、多靶点的特点，为进一步研究电针抗脑缺血再灌注损伤机制提供新思路和科学实验依据。但其具体通过何种通路影响自噬相关因子的表达目前尚不清楚，有待进一步研究。