UPLC-Q-TOF-MS分析芍药汤水煎液化学成分△

凌霄，李伟霞，王晓艳，赵娅，曹英杰

1.河南中医药大学 第一附属医院 药学部/中药临床评价技术河南省工程实验室，河南 郑州 450001；2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450001

芍药汤是“金元四大家”之一刘完素所创的名方，首载于《素问病机气宜保命集》，后世医家皆推此方为治疗湿热痢疾之主方，目前临床上仍被广泛应用于湿热下利腹泻。芍药汤全方由白芍Paeoniae Radix Alba、黄连Coptidis Rhizoma、当归Angelicae Sinensis Radix、木香Aucklandiae Radix、槟榔Arecae Semen、甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma、大黄Rhei Radix et Rhizoma、黄芩Scutellariae Ariae Radix、肉桂Cinnamomi Cortex组成，是中医反治法的代表方剂。目前，国内外对芍药汤的研究以临床研究和药理实验研究为主，该方化学成分的研究集中在芍药苷、小檗碱等成分的含量测定。有学者对芍药汤开展了指纹图谱研究，确定了其中13个共有峰，但仅对其中的3个峰进行了成分识别[1]。陈琳等[2]用高效液相色谱法测定了芍药汤中盐酸小檗碱的含量。但目前，芍药汤整体化学轮廓仍不清晰，方中成分的定性、定量分析较为欠缺，严重制约了芍药汤的深入研究和现代化研发。

随着液质联用技术的发展，超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)在中药成分分析中的应用越来越多。UPLC-Q-TOF-MS可给出化合物的准确相对分子质量及二级碎片信息，可以较准确地推测未知化合物的结构。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS对芍药汤水煎液中的化学成分进行了结构推测鉴定，共鉴定了33个成分，为芍药汤药效物质基础研究、质量控制及现代化开发应用研究提供参考。

1 材料

1.1 药材

实验所用药材均购自张仲景大药房，由河南中医药大学第一附属医院药检室施钧瀚副主任药师鉴定分别为毛茛科植物芍药PaeoniatactiloraPall.的干燥根、毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎、伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根、菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根、棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎、蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根和根茎、唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根和樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥树皮。

1.2 试剂

对照品芍药苷(纯度：96.8%，批号：110736-201842)、大黄素甲醚(纯度：99.0%，批号：110758-201616)、黄芩苷(纯度：95.4%，批号：110715-201821)、汉黄芩苷(纯度：98.5%，批号：112002-201702)、汉黄芩素(纯度：99.0%，批号：111514-201706)、甘草酸二铵(纯度：93.2%，批号：101050-201101)、甘草苷(纯度：95.0%，批号：111610-201607)、盐酸小檗碱(纯度：85.9%，批号：110713-201814)、盐酸药根碱(纯度：89.5%，批号：110733-201609)均购于中国食品药品检定研究院；对照品白芍苷(纯度：99.0%，批号：16051601)购于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱纯，Tedia公司)；实验用水为哇哈哈蒸馏水。

1.3 仪器

UPLC-Q-TOF-MS系统：ACQUITY-UPLC型高效液相色谱仪、XEVO-G2XSQTOF飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI，美国Waters公司)。

2 方法

2.1 对照品溶液制备

分别称取芍药苷、大黄素甲醚、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、甘草酸二铵、甘草苷、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、白芍苷约1 mg，精密称定，用甲醇溶解，配制至质量浓度为1 mg·mL-1的对照品母液。取上述对照品母液适量，用甲醇稀释为0.02 mg·mL-1的溶液，备用。

2.2 供试品溶液制备

按《素问病机气宜保命集》中芍药汤的各味药配比[3]，采用临床使用中的煎煮方法，称取白芍30 g、黄连15 g、当归15 g、木香6 g、槟榔6 g、甘草6 g、大黄9 g、黄芩15 g、肉桂5 g至圆底烧瓶中，加水浸泡30 min后，第1次加6倍量水(约650 mL)，煎煮40 min后，2层纱布滤过，残渣加4倍量水(约400 mL)，煎煮30 min后，两层纱布滤过，合并2次滤液，减压浓缩至1 g·mL-1(以生药量计)。取其中2 mL浓缩液，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，超声30 min，15 000×g离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，作为供试样品，待测。

2.3 液相色谱分析条件

采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～20%B；10～20 min，20%B；20～35 min，20%～25%B；35～40 min，25%～60%B；40～50 min，60%～80%B；50～51 min，80%～100%B；51～55 min，100%B；55～60 min，100%～10%B)；体积流量0.4 mL·min-1，柱温25 ℃；进样量4 μL。

2.4 Q-TOF-MS分析条件

电喷雾离子源(ESI)，正、负离子扫描模式；毛细管电压2500 V；锥孔电压40 V；脱溶剂气温度250 ℃；脱溶剂气体积流量600 L·h-1；源温度100 ℃；锥孔气体积流量50 L·h-1；亮氨酸-脑啡肽溶液在线校正(正离子模式mz556.277 1，负离子模式mz554.261 5)；扫描范围mz：100～1000，扫描方式为全扫描。采用Waters UNIFI软件对采集的数据进行处理。

3 结果

3.1 化学成分分析

共鉴定33个化学成分，其中化合物1、2、5～7、10、11为萜类化合物，化合物15、29、32为蒽醌类化合物，化合物3、9、13、23、25～28、30、31为黄酮类化合物，化合物4、17～22、24为生物碱类化合物，芍药汤水煎液样品在正、负离子模式下的总离子流图见图1。主要成分对照品及样品质谱图见图2～3。

注：A.正离子模式；B.负离子模式。图1 芍药汤水煎液的正、负离子模式下的总离子流图

注：A.白芍苷；B.大黄素甲醚；C.甘草苷；D.甘草酸；E.汉黄芩苷；F.汉黄芩素；G.黄连碱；H.黄芩苷；I.芍药苷；J.小檗碱；K.药根碱；图3同。图2 芍药汤水煎液中主要成分对照品质谱图

图3 芍药汤水煎液样品中主要成分质谱图

3.2 结构鉴定

3.2.1萜类化合物 芍药中的化合物多为萜类化合物，本研究从芍药汤水煎液中鉴定了7个萜类化合物，下面主要解析代表性成分芍药苷和白芍苷的结构鉴定过程。化合物7在负离子模式下得到甲酸加和离子峰mz525.160 3[M+HCOO]-，mz449[M+HCOO-C3H8O2]-，脱去1分子苯甲酸乙酯和水形成特征碎片离子mz327[M+HCOO-C3H8O2-H2O-HCOO]-，脱去糖基形成特征碎片离子mz165[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4]-，再脱去羧基后形成特征碎片离子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H13O4-CO2]-，结合文献报道[3-7]和与对照品对比(图2～3)，确定化合物7为芍药苷。

化合物5在负离子模式下得到甲酸加和离子峰mz525.110 2[M+HCOO]-、准分子离子峰mz479[M-H]-，推测其分子式为C24H30O13，脱去1分子苯甲酸，形成特征碎片离子mz357[M+HCOO-C7H7O2-HCOO]-，脱去1个糖苷形成特征碎片离子mz121[M+HCOO-C6H11O5-C10H12O4-HCOO]-，查阅文献[4-8]，与白芍苷的质谱裂解规律一致，与对照品对比后(图2～3)，确定化合物5为白芍苷。芍药汤中代表性萜类成分质谱裂解规律见图4。

3.2.2蒽醌类成分 大黄中含有大量蒽醌类成分。本研究从芍药汤水煎液中鉴定了3个蒽醌类成分，下面主要解析代表性成分大黄素甲醚的结构鉴定过程。在负离子模式下，化合物29的准分子离子峰为mz283.110 2[M-H]-，推断其分子式为C16H12O5，在质谱裂解过程中，脱去甲基，产生特征碎片离子mz268[M-H-CH3]-，查阅文献[9-11]，与大黄素甲醚的主要裂解规律一致，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物29为大黄素甲醚。大黄素甲醚质谱裂解规律见图5。

图4 芍药汤中代表性萜类成分质谱裂解规律

图5 芍药汤中代表性蒽醌类成分大黄素甲醚质谱裂解规律

3.2.3黄酮类化合物 黄芩和甘草中的化合物多为黄酮类化合物，本研究从芍药汤水煎液中鉴定出10个黄酮类成分，下面主要解析4个代表性成分的结构鉴定过程。在负离子模式下，化合物25的准分子离子峰为mz445.077 0[M-H]-，推断其分子式为C21H18O11，误差为-0.4×10-6。在质谱裂解过程中，其准分子离子峰脱去葡萄糖羧基产生特征碎片离子mz269[M-gluA-H]-，特征碎片mz269，继续脱去CO，产生特征碎片离子mz239[M-gluA-CO-H]-。查阅文献[11-13]和对照品比对后(图2～3)，发现与黄芩苷的主要裂解特征一致，确定化合物25为黄芩苷。

在负离子模式下，化合物28的准分子离子峰为mz459.112 3[M-H]-，推断其分子式为C22H20O11。在裂解过程中，其准分子离子峰脱去葡萄糖羧基产生特征碎片离子mz283[M-gluA-H]-，准分子离子峰脱去葡萄糖羧基和甲基产生碎片离子mz268[M-gluA-CH3-H]-，与文献报道的裂解特征一致[11-12]，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物28为汉黄芩苷。

在正离子模式下，化合物30的准分子离子峰为mz285.100 1[M+H]+，推断其分子式为C16H12O5，其准分子离子峰脱去甲基，产生特征碎片离子mz270[M-CH3-H]+，该裂解特征和文献报道一致[12-13]，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物30为汉黄芩素。

在正离子模式下，化合物8的准分子离子峰为mz419.251 4[M+H]+，其准分子离子峰脱去葡萄糖基和树胶醛糖基得到特征离子碎片mz271[M+H-glucosyl-arabinosyl]+，负离子质谱中捕捉到准分子离子峰417.119 0[M-H]-，推测分子式为C21H22O9，结合文献报道[14-15]，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物8为甘草苷。

在负离子模式下，化合物31的准分子离子峰为mz821.203 6[M-H]-，其准分子离子峰脱去葡萄糖醛酸基，得到特征离子碎片mz645[M-gluA-H]-，脱去2个葡萄糖醛酸基，得到特征离子碎片mz469[M-gluA×2-H]-，查阅文献[15-16]，与甘草酸主要裂解特征一致，与甘草酸对照品比对后(图2～3)，确定化合物31为甘草酸。

由上述实验结果可知，含葡萄糖醛酸-O-苷类化合物通常会产生失去葡萄糖醛酸基(mz176)的特征碎片离子。芍药汤中代表性黄酮类成分质谱裂解规律见图6。

3.2.4生物碱类化合物 黄连中的主要成分为生物碱类成分，本研究从芍药汤水煎液中鉴定了8个生物碱类成分，下面主要解析3个代表性成分的结构鉴定过程。化合物22的准分子离子峰为mz336.012 1，黄连中的生物碱为季胺型生物碱，其准分子离子峰即为相对分子质量，因此推测化合物22的分子式为C20H17NO4，准分子离子峰脱去甲基后进一步脱去与N相连的H，形成特征碎片离子mz320[M-CH4]+，准分子离子峰脱去1个甲基和CO后形成特征碎片离子mz291[M-CH3-CO]+，查阅文献[16-18]，与小檗碱的主要裂解特征一致，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物22为小檗碱，质谱裂解规律见图7。

化合物21的准分子离子峰为mz338.021 6，推测其分子式为C20H19NO4，其准分子离子峰脱去甲基后脱去与N相连的H，形成特征碎片离子mz322[M-CH4]+，碎片离子mz322[M-CH4]+脱去CO，形成特征碎片离子mz294[M-CH4-CO]+。上述裂解与文献报道药根碱的主要裂解特征一致[16-18]，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物21为药根碱。

化合物17的准分子离子峰为mz320.142 2[M]+，推测其分子式为C19H13NO4，脱去CH2O后形成特征碎片离子mz290[M-CH2O]+，与文献中黄连碱裂解规律一致[16-18]，与对照品比对后(图2～3)，确定化合物17为黄连碱。芍药汤水煎液主要化学成分鉴定结果见表1。

图6 芍药汤中代表性黄酮类成分质谱裂解规律

图7 芍药汤中小檗碱质谱裂解规律

表1 芍药汤水煎液主要化学成分鉴定结果

续表1

4 讨论

芍药汤全方由9味中药组成，化学成分复杂，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术对芍药汤水煎液主要化学成分进行鉴定。鉴别出的主要化合物来源于芍药、黄连、黄芩、大黄、当归和甘草，方中肉桂、木香中的挥发性成分较少鉴别，其原因可能是提取方式的选择和药物用量大小。由于临床中芍药汤的使用方式以水煎服为主，为了更加准确地了解芍药汤临床实际应用时的有效成分，本研究中汤液的制备方式与临床实际应用保持一致，采用水煎煮，而木香、肉桂中的标志性成分挥发性较强，在煎煮中容易损失，且木香、肉桂在全方中用量较小，因此未鉴别出木香、肉桂中的大量挥发性成分，后续需要针对芍药汤中的挥发性成分专门设计考察提取工艺，对方中挥发性成分进行更加完善的分析。

本研究的色谱分离结果显示，部分色谱峰没有完全分离，但是利用质谱高分辨的特点，可以通过相对分子质量的差异，准确区分不同化合物，通过准分子离子峰和二级质谱产生的特征性碎片离子，可对芍药汤水煎液进行定性分析。但本研究仍存在许多不足，部分药物的部分成分未成功鉴别，而从总离子流图中可看出，仍有部分响应值较高的峰，其质量数、碎片离子数据未能与现有文献报道匹配，提示芍药汤水煎液中仍有许多未知成分，需要进一步研究探索。

本研究首次采用UPLC-TOF-MS鉴定芍药汤水煎液中33个化学成分，该法可以简便、快速地对方剂中化学成分进行定性研究，有利于深入研究芍药汤药效物质基础。此外，芍药汤中的挥发性成分在传统的水煎法中损失较大，对芍药汤中挥发性成分需要专门设计提取工艺，以便进一步的鉴别分析。