中国传统发酵食品研究现状及前沿应用技术展望

陈 坚，汪 超，朱 琪，张 娟

(江南大学 未来食品科学中心/生物工程学院，江苏 无锡 214122)

发酵食品是指经过微生物(细菌、酵母和霉菌等)的发酵作用或经过生物酶的作用使加工原料发生重要的生物化学变化及物理变化后制成的食品。发酵食品以其低廉的价格，独特的风味以及丰富的营养成为人们生活中必不可少的一部分。中国传统发酵食品种类繁多，其原料同样来源广泛。根据原料的不同，中国传统发酵食品主要可分为酒类食品，如白酒、啤酒、黄酒、葡萄酒等；谷类食品，发酵面食(馒头、包子、馕、烙饼)、发酵米粉、酸浆面、醪糟、面酱等；豆类食品，如各种豆豉、腐乳、豆瓣酱、酱油、豆汁等；蔬菜类食品，如各种泡菜、腌渍菜等；水果类食品，如西瓜酱、山楂酱、果酒、果醋等；肉类食品，如金华火腿、腊肉、香肠等；水产类食品，如熏鱼、腊鱼、虾酱、鱼酱、鱼酱油等；乳制品，如扣碗酪、奶豆腐、乳扇、酪干、奶卷、奶饽饽、酸奶等；其他类食品，如各种发酵茶(普洱茶、红茶)等。

1 发酵食品生产过程特点

1.1 发酵工艺与环境复杂

1.2 混菌体系

传统食品发酵微生物大多为混菌发酵体系，由于传统发酵工艺的开放性与粗放性导致其微生物来源较为广泛，主要来源于曲种、原料、发酵环境、生产工具等[2]，因此发酵微生物群落具有高度的多样性和复杂性。原始的混菌体系经过特定发酵环境(温度、pH值和养分等)的长期驯化，形成了稳定的由核心菌群主导原料转化和风味形成的混菌体系，从而赋予发酵食品独特的风味与营养。这个混菌体系相当于一个微型的工厂，每个微生物在独立工作的同时也通过互作产生紧密的联系。然而，在发酵生产的过程中，往往会出现原料转化率低、风味生成不足、不良副产物伴生、对环境变化敏感等问题。为解决上述问题，必须透彻解读传统发酵食品的菌群结构及其演替规律，科学建立微生物与代谢物之间的联系，筛选包括不可培养的功能微生物，解析微生物间的互作关系，最终通过添加功能微生物调控菌群或人工重组菌群来实现传统发酵食品品质的提升和发酵工艺的升级。

1.3 经验式的感官评定

食品发酵工艺较为复杂，需要定时监控发酵产品的重要指标，从而保证整个发酵过程能够稳定有效地进行。目前，对相关指标的监测手段有限，且无法适配大批量、大规模的生产。因此，大多通过经验丰富的工人对发酵产品的相关特性进行感官分析评定其发酵程度，并根据判断结果调整发酵参数。因此，有必要对重要发酵指标进行量化，建立高效的检测与监控系统。

2 发酵食品研究现状

长期以来，人们对传统发酵食品研究的最终目的都聚焦于风味与健康，期望通过研究解决发酵食品中特征风味、邪杂味、营养保健物质和抗营养因子相关的5个重要问题(4W1H)：1)什么物质(what)，即对影响食品品质的物质定性与定量；2)什么时间、哪个过程(when)，即确定目标物质产生的关键发酵时间节点；3)什么地方(where)，即确定目标物质产生的关键位置、关键生成条件和关键生成方式；4)谁是主要作用者(who)，即确定影响目标物质生成的关键微生物；5)如何调控(how)，即基于4W的结果通过强化或消除等方法改良发酵食品的风味或品质。

传统方法对发酵食品的研究效率低、耗时长、投入精力大且研究不全面。随着宏组学技术的兴起，大量的基于组学技术的研究工作被投入到了传统发酵食品的混菌体系研究之中。如对白酒酒醅[3-4]和大曲[5-14]、醋[10,15-17]、腐乳[18]、泡菜[19-20]、大酱[21-22]等传统发酵食品的研究，内容涵盖了微生物群落结构与演替规律的解析，微生物互作关系的初步探索，环境理化因子对菌群结构的影响评估，功能微生物、功能基因、新物种以及新基因的挖掘，核心菌群的确定等。其中Gan等[5]利用宏基因组与扩增子测序技术比较了发酵过程中形成的3种茅台大曲的微生物群落组成与功能差异，揭示了大曲发酵过程中不同阶段微生物结构的特征，加深了对微生物群落与大曲功能特性间关联性的理解。Xie等[21]通过宏蛋白组学技术对传统型与产品型北方大酱微生物功能比较，发现传统型大曲的食品安全性更高，两者在关键酶回溯的功能微生物结构上也具有差异。上述研究结果可为后续筛选功能微生物来优化大酱品质提供理论依据。Zheng等[3]结合宏蛋白组学技术、代谢组学技术与扩增子测序技术全面比较了30年和300年窖龄窖泥在酶系、物系与菌系结构上的差异，结果显示300年窖龄窖泥具有更强的生香能力。Huang等[18]通过扩增子测序技术与代谢组学技术解析腐乳发酵过程中微生物群落演替规律与代谢物质的变化情况，并通过Pearson关联网络分析探究微生物与代谢物间的潜在联系，这为腐乳发酵机制的研究提供了一定的参考。Wu等[17]运用宏基因组学与代谢组学技术构建了镇江香醋发酵过程中关键物质的代谢通路并阐释了微生物在不同芳香物质形成过程中的作用。该类研究既为传统食品发酵机制的解析提供了理论依据，也为传统发酵食品品质的改良提供了科学指导。

3 发酵食品前沿应用技术

将基因工程、合成生物学、分子生物学等前沿生物技术应用于传统发酵食品的生产中，能有效地定向改良发酵食品的风味感官，增加其营养成分以及消除抗营养分子，同时能维持发酵食品品质的长期稳定性。例如应用合成生物学使工业酿酒酵母合成单萜分子芳樟醇和香叶醇，在啤酒中形成更令人愉悦的啤酒花风味，而不用添加啤酒花[23]。

3.1 人工感知技术的应用

随着感知科学基础研究的快速发展，如酸味受体被鉴定，同时确定了酸甜苦咸鲜5种味道的神经元结构[24]，研究表明：酸味使用舌头专用的味觉受体细胞(TRC)，以精细调节大脑中的味觉神经元触发厌恶行为，使得人工感知器官可能被实现模拟和应用。

虽然人工智能技术进行风味物质的挖掘、组合，实现人工感知器官(电子眼、电子鼻、电子舌)模拟研究还处于初级阶段。只能实现对现有产品有效分类，但无法指出样品间的物质、感官差异。但技术的迭代日新月异，不久的将来人工感知器官将得到更加广泛的应用。如同生物传感器的发展经历了从“酶电极” “酶、免疫、微生物传感器” “细胞传感器” “组织传感器” “生物芯片”到“多功能传感器”的演变。

Although phosphor particles are small, the initial and final settling velocities are not significantly different, hence acceleration can be ignored. When the particles are stable or settling down, f can be expressed as:

运用智能感官等技术进行食物感知、物质分析、仿生传感、感官评价、消费者分析。如运用计算机视觉模仿视觉观察食物外观特征，运用电子鼻模仿人体嗅觉器官嗅出食物香味，应用机械嘴模拟吃食物过程，应用机械触觉模拟手指触觉，对食物软硬度流动性等质构情况提供信息等技术。通过数据学习、训练，输出食品的多感官特性描述，如产品的消费者情感影响、产品与消费者目标差异等。

3.2 发酵食品微生物新技术的应用

随着一批将对生物技术产业产生巨大影响的技术出现与高速发展，我们能结合多元化的手段对关键发酵微生物进行定向化筛选与改造，获得传统方法难以筛选到的功能微生物，包括不可培养的功能微生物，编辑关键微生物遗传信息，创建全新的、高效的微生物群落，从而赋予整个微生物细胞工厂更高的发酵智慧。例如，可使微生物拥有原料自识别和高利用能力、风味物质代谢的适度自控、营养物质高积累和抗营养因子生物降解能力，以及复杂环境自适应和不良条件的强抵御能力等。

3.2.1微生物的快速精确定量技术

目前，解读传统发酵食品混菌体系的组学技术已较为成熟，但组学技术只能对微生物进行相对定量且无法区分死菌与活菌数，然而想要解析微生物与目标代谢物间的关联性则需要了解相关活性功能微生物在发酵过程中绝对量的变化，因此有必要结合前沿生物技术构建快速的发酵食品活性微生物的快速精确定量技术。目前，发酵食品的微生物定量检测方法的对比见表1。

表1 发酵食品微生物绝对定量技术Tab.1 Absolute quantification methods of microorganisms in fermented food

3.2.1.1 EMA/PMA-qPCR技术

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。魏娜等[25]利用qPCR对浓香型白酒不同窖龄窖泥微生物区系特定种群的快速定量检测，再进一步结合代谢产物指标可用于窖池中难培养微生物种群的功能分析和评定；李凤珠等[26]基于qPCR建立一种准确定量榨菜腌制过程中细菌和真菌数量的方法。

但普通的qPCR只能反应目标微生物总的拷贝数，无法区分死、活微生物的数量。EMA/PMA-qPCR 活菌检测技术是利用新型核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide，EMA)或叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)渗入膜损伤的细胞后，与双链 DNA 或 RNA 发生非可逆的共价结合，从而抑制膜损伤细胞DNA 在 PCR 反应中的扩增，使 qPCR 反应结果只反映活细胞 DNA 含量[27]。盖冬雪[28]采用PMA-qPCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。段亮杰等[29]利用 PMA-qPCR 法快速、准确地检测黄酒酿造过程中 5 种乳杆菌的活菌数，为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viable but nonculturable，VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段。Lü等[30]对与红曲糯米酒传统酿造有关的主要微生物的PMA-qPCR参数进行了标准化并成功将优化的PMA-qPCR方法应用于红曲糯米酒的传统酿造过程中总细菌，总真菌，酵母菌，酿酒酵母和植物乳杆菌等微生物数量的监测。

3.2.1.2 流式细胞术

流式细胞术(flow cytometry)是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征及根据这些物理化学特征精确分选细胞的技术，主要包括流式分析与流式分选两部分[31]。它可以高速分析上万个细胞，速度快、精度高、准确性好，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。近年来，流式细胞术被广泛应用于食品微生物的检测。黄韵[27]采用流式细胞术对冷鲜肉中的具有VBNC状态的单增李斯特菌进行定量检测，经研究发现，流式细胞术相对于平板计数法和PMA-qPCR定量能够更加快速且精准地检测食品中的致病菌。Malacrino等[32]利用流式细胞术对葡萄酒中的酵母与苹果酸- 乳酸菌同时进行快速有效的定量。Conacher 等[33]通过流式细胞术对合成酵母菌群系统中微生物数量的动态变化进行实时监控。

3.2.1.3 CRISPR-Cas12a耦合荧光探针系统

随着分子技术的发展，出现了一批新兴方法，例如基于CRISPR-Cas12a耦合荧光探针系统，可实现快速、简便、准确的特异性微生物定量[34]，在食品微生物检测方面有着巨大的潜力。通过优化荧光强度响应的动态范围，强化微生物种类检测的特异性，开发微生物检测试纸，食品微生物检测有望实现实时定量快速检测，为混菌发酵过程监控与食品安全检测提供有力工具[35]。

3.2.2人工合成技术

传统发酵食品中的原生混菌系统具有复杂、稳定性差和功能冗余等缺陷，会造成原料转化的低效和不良副产物的生成，同时也会增加发酵产品品质和风味的波动性。实现功能菌群的人工合成(组装与调控)，将有助于解决风味、安全与健康等问题。

3.2.2.1 人工重组菌群

人工重组菌群有助于在模拟环境中实现传统发酵食品风味的重现。为实现人工菌群的选择与重组，首先需要在多组学联用分析研究的基础上，探究传统发酵食品的微生物群落结构及其演替规律，通过酶系、菌系和物系间的互作关系解析核心功能菌群。在此基础上，评估影响菌群的生物因子与非生物因子，并通过模拟发酵分析重组菌群的最佳结构比例[36]。Wang 等[4]运用扩增子测序技术结合代谢组学技术解析白酒发酵过程中的核心微生物菌群，并通过人工合成菌群重现白酒发酵，这对发酵食品的可操作性和连续性生产具有重要意义。

3.2.2.2 人工调控菌群

通过添加功能微生物调整菌群结构，可以使其拥有更强的原料转化效率、风味合成能力以及有害物质的降解能力[37]。传统生态系统中具有微生物演替和环境变量的自然发酵，导致发酵食品品质存在波动性。He等[6]提出了定向微生物扰动，用于食品发酵中微生物群的调控和目标产物的增加。通过接种Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis调整大曲菌群结构来强化大曲功能。结果表明：强化大曲的生物扰动明显影响了微生物群落，增加了己酸菌、梭菌、曲霉、念珠菌、甲烷菌和甲烷菌的丰度，降低了乳酸杆菌的丰度。共现分析表明：生物扰动增加了微生态系统中物种间相互作用的多样性和复杂性，从而促进了风味代谢产物(如己酸，己酸乙酯和己酸己酯)的生成。这些结果表明：通过功能菌群的种间相互作用，强化大曲的生物扰动对于风味代谢的促进是可行的[38]。人工调控菌群对于提升中国白酒以及其他发酵食品的品质至关重要。

3.3 发酵食品感知新技术的应用

深入探索发酵食品感知技术，研究食品的感官特性和消费者的感觉，探究感官交互作用和味觉多元性，解析大脑处理化学和物理刺激过程从而实现感官模拟，理解感官的个体差异，多学科交叉进行消费者行为分析，评估感官、消费者的方法学[39]。构建“发酵+食品+神经生物学+大数据”的系统化研究体系。

3.3.1基于神经生物学的发酵调控

如找出发酵产品中风味的关键物质成分，了解其造成食用后舒适、不适的机制，确定干预措施，提升产品食用后的舒适度。构建初舒适度模型及理论，建立动物模型，确定舒适度指标。厘清舒适度的标志物和机理，开展行为学、体外脑组织培养高通量筛选技术、生化和生理学实验。进而开展人体测试、转化研究。

3.3.2基于大数据的风味网络技术

风味化合物不等于风味，不同种类和比例甚为重要；因为人工难以及时处理多类信息、实现全局优化，需要依靠大数据和人工智能技术建立风味网络；解决风味问题，优化已有风味，预测可能风味，开发新型风味及风味食品。

4 结 语

发酵微生物更智慧、发酵过程更智能、发酵产品更美味是新时代发酵食品技术的追求。未来，应以改善中国传统发酵食品为抓手，进一步加速开发发酵食品的关键共性技术、现代工程技术、前沿引领技术和颠覆性技术,推动我国整体食品发酵产业的创新式发展，引领世界食品发酵产业的发展迭代。