抗坏血酸对猴头菇β-葡聚糖表观黏度及结构特征的影响

方晓晖，邹明悦，聂少平，殷军艺

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

猴头菇营养丰富，含有蛋白质、多糖、膳食纤维以及人体必需的8种氨基酸等营养成分。猴头菇β-葡聚糖(Hericiumerinaceusalkali-extracted polysaccharide，HEAEP)等作为猴头菇多糖的代表性多糖成分[1-2]，具有增强免疫功能[3-6]、降低血糖与血脂水平[7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]等活性；此外，β-葡聚糖具有增稠、稳定和凝胶特性，可以作为食品添加剂添加到食品中，进而保持食品体系的稳定性[11]。

抗坏血酸，又称维生素C，具有抗氧化[12-13]、抗衰老[14]等生物活性，在食品中常被作为营养强化剂和抗氧化剂(高浓度时)；低浓度的抗坏血酸还可作为还原剂[15],引发氧化反应，影响食品中多糖的表观黏度。

在食品加工过程中，多糖可与抗坏血酸共存[16]，这可能会对多糖及相应的食品体系产生影响。研究发现，低浓度抗坏血酸与过氧化氢结合会使β-葡聚糖表观黏度降低[17]，而且β-葡聚糖分子质量下降。这是因为多糖与抗坏血酸反应过程中有羟自由基形成[16-18],且羟自由基诱导多糖糖苷键断裂，从而导致多糖表观黏度下降[19]。然而，已有报道缺少对不同作用条件(如pH值、温度、不同金属离子、作用时间等)下抗坏血酸与多糖相互作用的系统性研究，同时对多糖结构是否发生变化关注不够，更多的是研究单一浓度下抗坏血酸与金属离子、过氧化氢等共同作用对多糖降解的影响[20-22]。本实验拟系统研究不同因素作用下抗坏血酸对HEAEP表观黏度的影响，并从单糖组成、分子质量、糖苷键等角度探讨各因素相互作用后HEAEP结构特征变化情况，希望为抗坏血酸与β-葡聚糖共存食品的生产提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

猴头菇产地为吉林省长白山，购于江西南华药业有限公司。

抗坏血酸(纯度≥99.0%)、碘甲烷(分析纯)、氧化氘(分析纯)、单糖标准品(色谱级)包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，美国Sigma-Aldrich公司；木糖(色谱级)，百灵威科技有限公司；牛血清蛋白(分析纯)、不同分子质量的葡聚糖标准品(色谱级)(Mw为2.0×106、7.0×104、6.0×104、4.0×104、1.0×104Da)和葡萄糖(Mw为180 Da)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝G-250(分析纯)，Fluka进口分装；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

E2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Dionex ICS 5000型离子交换色谱系统、Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo公司；Milli-Q型超纯水仪，美国Millipore公司；12 L立式冷冻干燥机，美国Labconco公司；ARES-G2型流变仪，美国TA公司；JSM 6701F型场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)，日本电子株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1HEAEP的制备

根据前期的提取方法[23]，即猴头菇子实体粉碎过40目筛，称取一定量的猴头菇粉，以1∶15的料液比(g/mL)，加入体积分数95%的乙醇溶液浸泡24 h，取残渣沸水浸提、弃水。残渣分别用0.1 mol/L NaOH与0.01 mol/L NaBH4混合液、0.5 mol/L NaOH与0.01 mol/L NaBH4混合液，按1∶10的料液比(g/mL)提取12 h，过滤、去渣。提取液用3 mol/L HCl中和，离心(4 800 r/min，10 min)、收集上清液，并浓缩至原体积的1/3，加入95%乙醇(乙醇终浓度为80%)醇沉过夜。离心收集沉淀，沉淀依次添加无水乙醇、丙酮和无水乙醚浸泡、洗涤、离心，之后加水复溶并进行Sevag法脱蛋白后蒸馏水复溶，浓缩、透析36 h，冷冻干燥，得到碱提水溶性HEAEP。

1.3.2HEAEP表观黏度的测定

1.3.2.1 不同抗坏血酸浓度条件下HEAEP表观黏度的测定

分别向质量分数为0.25%HEAEP溶液中加入不同浓度的抗坏血酸，并置于55 ℃水浴锅中，搅拌30 min后于室温下静置12 h。用流变仪测定多糖的表观黏度(夹具直径为40 mm，测定间隙为0.046 mm)，测试温度为25.0 ℃，剪切速率为0.1～1 000 s-1，采用TA Orchestrator-7软件采集数据。

1.3.2.2 不同作用温度条件下HEAEP表观黏度的测定

将一定浓度的抗坏血酸溶液加入不同温度的0.25%的HEAEP溶液中，磁力搅拌30 min后于室温静置12 h，测定多糖的表观黏度。

1.3.2.3 不同pH值条件下HEAEP表观黏度的测定

将一定浓度的抗坏血酸溶液加入不同pH值的0.25%的HEAEP溶液中，在55 ℃的水浴锅中搅拌30 min，室温静置12 h，测定多糖的表观黏度。

1.3.2.4 不同作用时间条件下HEAEP表观黏度的测定

将加入质量分数为0.025 00%的抗坏血酸的HEAEP溶液置于55 ℃水浴锅中，搅拌一段时间后，室温静置12 h，测定多糖表观黏度。

1.3.2.5 不同金属离子条件下HEAEP表观黏度的测定

分别向0.25%的HEAEP溶液中加入不同浓度的硫酸亚铁、硫酸铜，再加入质量分数为0.025 00%抗坏血酸溶液，55 ℃下搅拌30 min，室温静置12 h，测定多糖表观黏度。

1.3.3HEAEP结构特征分析

基于1.3.2的实验结果，向0.25% HEAEP溶液中分别加入质量分数为0.025 00%、0.100 00%的抗坏血酸，在55 ℃水浴锅中磁力搅拌30 min，室温静置12 h。将样品分别转移至透析袋中，用超纯水透析72 h，浓缩、冷冻干燥，依次命名为：HEAEP-1、HEAEP-2(HEAEP-1为0.25%HEAEP与0.025 00%抗坏血酸作用产物，HEAEP-2为0.25% HEAEP与0.100 00%抗坏血酸作用产物)。

1.3.3.1 单糖组成分析

准确称取5 mg样品于厚壁耐压瓶中，在冰浴条件下加入12 mol/L浓硫酸0.5 mL，磁力搅拌30 min后加入2.5 mL超纯水。将反应物转移至120 ℃油浴锅中磁力搅拌2 h，然后将水解液加水定容、稀释，过0.22 μm水系滤膜，进样检测[24]。

色谱检测条件：离子交换色谱系统(配有脉冲安培检测器)，采用CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm，Dionex，CA)和CarboPac PA20保护柱(3 mm×30 mm，Dionex，CA)串联使用。流动相：A为250 mmol氢氧化钠，B为超纯水，C为1 mol/L醋酸钠，D为超纯水，流速为0.5 mL/min，进样量为10 μL。

1.3.3.2 分子质量分析

将多糖用流动相配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，用0.22 μm尼龙滤膜过滤进样，采用高效体积排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)-多角度激光光散射(multiangle laser light scattering，MALLS)系统分析检测[25]。流动相：0.1 mol/L NaNO3(含有质量分数0.02%NaN3)，流速0.6 mL/min；进样量为100 μL。利用ASTRA 6.1软件采集和分析数据。

1.3.3.3 红外光谱分析

在波数为4 000～400 cm-1范围内对样品进行红外光谱分析。

1.3.3.4 糖苷键连接方式分析

称取干燥的多糖样品2～3 mg于反应瓶中，加入1 mL无水二甲基亚砜(DMSO)，搅拌至彻底溶解后加入NaOH 20 mg，室温下搅拌3 h，滴加无水碘甲烷0.3 mL，于室温下搅拌反应2.5 h后加入蒸馏水终止反应。用二氯甲烷(1 mL)萃取反应体系，向干燥的甲基化多糖中加入0.5 mL 4.0 mol/L的三氟乙酸，密封并置于100 ℃烘箱中水解6 h，用硼氘化钠还原。向干燥的水解产物中加入0.5 mL醋酸酐，乙酰化2 h，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。PMAA经氮气吹干后复溶于二氯甲烷中，进行GC-MS分析[26]。

1.3.3.5 固体形貌分析

将抗坏血酸处理前后的样品配制成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，置于液氮中冷却10 min，冷冻干燥。喷金后于SEM下观察，采用XT Microscope Control软件釆集图谱。

2 结果与讨论

2.1 抗坏血酸对HEAEP表观黏度的影响

图1为抗坏血酸浓度、作用温度、体系中的金属离子、pH值和作用时间对HEAEP表观黏度的影响。由图1(a)可知，当抗坏血酸质量分数在0.006 25%～0.100 00%时，随浓度的升高，抗坏血酸降低HEAEP表观黏度效果越好；当质量分数达到0.100 00%时，抗坏血酸降低HEAEP表观黏度效果最好；当抗坏血酸质量分数在0.100 00%～0.500 00%时，结果相反。由图1(b)可知，作用温度对低抗坏血酸降代HEAFP表观黏度影响较小。图1(c)和图1(d)显示：过渡金属离子(Cu2+、Fe2+)，会促进抗坏血酸降低HEAEP的表观黏度，且金属离子浓度越高，HEAEP表观黏度下降效果越好；在相同离子浓度下，Cu2+比Fe2+具有更好的降解作用，这与Buettner等[27]的发现相似。此外，作用时间越长，表观黏度下降越明显。图1(e)显示，pH值对抗坏血酸降低HEAEP表观黏度效果也有一定影响，pH值在4时效果最为明显。Kivelä等[22]也报道了抗坏血酸在pH值为4.5时对HEAEP具有最佳的降解效果。

图(b)～(f)中抗坏血酸的质量分数均为0.025 00%。图1 不同因素对HEAEP表观黏度的影响Fig.1 Influence of different factors on apparent viscosity of HEAEP

抗坏血酸在低浓度下作为还原剂，可以引发氧化反应[28],破坏β-葡聚糖结构，从而使β-葡聚糖断链，导致其分子质量降低、表观黏度下降[29]。随着抗坏血酸浓度的升高，抗坏血酸表现出抗氧化性[30]，使得HEAEP表观黏度下降程度随抗坏血酸浓度的升高而变小。在过渡态金属离子(Cu2+、Fe2+)存在下，抗坏血酸降低多糖表观黏度效果更明显，这可能是基于Fenton反应产生羟自由基，即将抗坏血酸(AH2)氧化为脱氢抗坏血酸(DHA)，Fe3+还原成Fe2+[见式(1)]；同时将分子氧还原为H2O2[见式(2)]，然后在Fenton反应中将生成的H2O2分解为羟自由基，同时将Fe2+氧化为Fe3+[见式(3)]。

(1)

(2)

(3)

2.2 抗坏血酸对HEAEP结构特征的影响

根据图1(a)的分析结果，选择抗坏血酸降解HEAEP效果适中(0.025 00%)和最好(0.100 00%)的条件，作用后所得多糖记为HEAEP-1和HEAEP-2，探究抗坏血酸对HEAEP基本结构特征的影响。

2.2.1抗坏血酸对HEAEP单糖组成的影响

单糖组成分析结果显示，葡萄糖(62.22%)是HEAEP的主要成分，这与我们前期的研究结果[21]相似。HEAEP-1、HEAEP-2葡萄糖质量分数分别为64.19%、68.57%，即抗坏血酸作用前后HEAEP糖含量有一定提高。

2.2.2抗坏血酸对HEAEP分子质量的影响

图2为HEAEP的示差检测器信号图。由图2可见，HEAEP分子质量分布较宽，主要含有峰1和峰2两个组分。经抗坏血酸作用后，HEAEP-1、HEAEP-2的峰1组分对应的洗脱时间逐渐后移，表明经抗坏血酸作用后多糖分子质量下降。

图2 抗坏血酸作用前后HEAEP的示差检测器信号图Fig.2 HPSEC chromatogram of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.3抗坏血酸对HEAEP官能团的影响

图3为抗坏血酸作用前后HEAEP红外光谱图。由图3可见，HEAEP在波数为3 400、2 924、1 420、1 075 cm-1处均有多糖的特征吸收峰。在3 400 cm-1的宽吸收峰是O—H的伸缩振动，2 924 cm-1附近的峰为C—H伸缩振动。在894 cm-1处发现的吸收峰表明β-葡聚糖的存在。抗坏血酸处理前后在多糖中都能发现所有这些吸收峰，表明抗坏血酸处理后的HEAEP红外光谱特征未发生明显变化。

图3 抗坏血酸作用前后HEAEP红外光谱Fig.3 Infrared spectra of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.4抗坏血酸对HEAEP糖苷键类型的影响

抗坏血酸作用前后HEAEP甲基化分析和GC-MS分析结果见表2。HEAEP主要包含4种糖苷键类型，分别是端基葡萄糖残基Glcp-(1→)、(1→3)-连接的葡萄糖残基(→3)-Glcp-(1→)、(1→3，6)-连接的葡萄糖残基(1→3，6)-Glcp-(1→)，以及少量的(1→6)-连接的葡萄糖残基(→6)-Glcp-(1→)。HEAEP-1、HEAEP-2主要糖苷键类型及其比例与HEAEP基本一致。

表2 抗坏血酸作用前后HEAEP的糖苷键类型Tab.2 Types of glycosidic bonds of HEAEP before and after ascorbic acid treatment

2.2.5抗坏血酸对HEAEP固体形貌的影响

图4为抗坏血酸作用前后HEAEP的SEM图。由图4可知，HEAEP主要由线性、片状以及球状结构组成，抗坏血酸作用前后HEAEP的微观结构相似，HEAEP-1和HEAEP-2表面都含有大量的球状物，且线性与片状结构交联，这表明抗坏血酸与HEAEP相互作用对多糖固体形貌影响较小。

图片放大倍数：5 000倍图4 抗坏血酸作用前后 0.1 mg/mL HEAEP的SEM图Fig.4 SEM images of 0.1 mg/mL HEAEP before and after action of ascorbic acid treatment

3 结 论

以HEAEP为研究对象，将其与抗坏血酸相互作用，系统研究了不同条件(抗坏血酸浓度、金属离子、温度、pH值等)下抗坏血酸对HEAEP表观黏度的影响，并深入分析了抗坏血酸对HEAEP结构特征的影响。在抗坏血酸质量分数小于0.100 00%时，随着抗坏血酸质量分数的增加，抗坏血酸降低HEAEP表观黏度效果越好；当抗坏血酸质量分数超过0.100 00%时，质量分数越高，降解效果越差。过渡金属离子(Cu2+、Fe2+)的添加促进了抗坏血酸对HEAEP的降解，且金属离子浓度越高，HEAEP表观黏度下降效果越明显。作用温度对抗坏血酸降低HEAEP表现黏度效果不明显。相同条件下，抗坏血酸与HEAEP作用时间越长，表观黏度下降效果越明显，作用时间为12 h时表观黏度下降最多。不同pH值对抗坏血酸降低HEAEP表观黏度的效果也不同，pH值为4时效果最好。HEAEP与抗坏血酸相互作用后单糖组成和固体形貌无显著性差异，分子质量随抗坏血酸浓度的增加而减小。由红外光谱和糖苷键分析结果可知，抗坏血酸作用未对多糖官能团特征峰和糖苷键类型产生明显影响。研究不同环境下抗坏血酸与HEAEP相互作用，有助于认识和分析食品加工过程中，当HEAEP与抗坏血酸共存时多糖的降解情况，希望本研究可为猴头菇来源β-葡聚糖在食品加工中的应用提供一定的理论参考。