分散固相萃取- 超低温液液微萃取- 气相色谱质谱法测定烟熏及烧烤肉制品中16种欧盟优控多环芳烃

童兰艳，肖昭竞，代政华，李根容，龙 梅，杨茂芹

(重庆市计量质量检测研究院/重庆市食品安全工程技术研究中心/国家农副加工产品及调味品质量监督检验中心，重庆 401123)

随着社会经济水平的发展，肉及肉制品逐渐成为人们饮食的重要组成部分，根据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)统计，在2015年全世界平均每人每年肉的消耗量是41.3 kg，发展中国家和发达国家每人每年肉的消耗量分别为31.6 kg和95.7 kg。预计到2030年人均肉消耗量将在此基础上翻倍[1-2]。肉类具有丰富的营养成分为人体提供优质蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素，通过腌制、油炸、烟熏或发酵加工成肉制品来增加肉的风味或是延长肉的储存时间。但是，在2015年10月，国际抗癌机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)将加工肉制品培根、火腿、香肠等列为Ι类致癌物。研究证实，肉类食物在高温加工如烟熏、烧烤、油炸时，脂肪组织发生热解，或接触不完全燃烧物都会产生大量的多环芳烃[3-4]。

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，根据相对分子质量及苯环数，PAHs可以分为轻PAHs(2～4环)和重PAHs(多于4环)。目前已发现的致癌性PAHs及其衍生物已达400多种，是至今为止数量最多的一类致癌物[5]。PAHs的研究从环境领域开始，通过进一步研究发现环境中的PAHs可以通过富集转移进入食物中，如油脂、蔬菜水果、水产品和加工肉制品[6-8]。PAHs，特别是重PAHs化学性质稳定，容易在人体、生物体和沉积物中积累，破坏人体内的遗传物质，增加癌症的发病率，引发癌细胞增殖，严重危害人类生命安全。多环芳烃通常是指16种美国国家环保局(Environmental Protection Agency，EPA)优控的多环芳烃，部分具有遗传毒性、致癌性或潜在致癌性。2002 年由食品科学委员会(European Commission’s Scientific Committee on Food,SCF)提出的需优先控制的15种 PAHs，包括8种EPA 优控PAHs和7种新物质，在2006年，粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)加入具有致癌性的苯并[c]芴，构成15+1种欧盟优控多环芳烃，即为本研究所述16种欧盟优控多环芳烃，均为重质多环芳烃。

目前，对16种欧盟优控多环芳烃的检测方法的研究主要有高效液相色谱法[9]和气相色谱- 质谱联用法[10-11]。高效液相色谱- 荧光法(high performance liquid chromatography-fluorescence method,HPLC- FLD)广泛用于食物中多环芳烃的检测，是通过了美国环境保护署和欧盟食品安全局认证的检测方法[12]，但某些多环芳烃不具备荧光吸收，导致高效液相色谱荧光法能够测定PAHs的种类有限。而且，高效液相色谱- 荧光法分析时间长、基线易漂移等缺点，因此如何提高高效液相色谱法的检测效率和准确度是研究的重点。气相色谱质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC- MS)测定多环芳烃是多数国家标准中使用的检测方法[13]，GC- MS具有较高的特异性和灵敏度，是目前实验室针对低浓度残留物质检测广泛使用的检测方法。

烟熏和烧烤肉制品本身含色素、脂肪、有机酸等多种物质，同时肉制品中PAHs含量较低，前处理常用方法为索氏提取、加压液体萃取、固相萃取、凝胶渗透色谱净化[14-18]，这些前处理必需再经液液萃取及固相萃取进一步净化，而固相萃取法需用不同功能的萃取柱对色素和油脂进行净化，存在耗时长和成本高等问题。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction，DSPE)具有简便、快速和成本低廉的优点，近年来在兽药和农残领域得到广泛的应用和推广[19]。本研究通过优化样品前处理条件，对比超低温液液萃取和常温液液萃取效果，建立了超低温液液萃取联合分散固相萃取- 气相色谱质谱同时测定烟熏及烧烤肉制品中16种欧盟优控多环芳烃的方法，并对市售腊肉、烤肉串等样品进行了分析，结果显示该方法准确度高，重复性好，大大减少有机溶剂的使用，节约前处理时间。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

GC- 2010 plus型气相色谱仪配SHIMAZU QP2020型质谱仪，日本岛津公司；Quintix224- 1CN型电子天平，德国Sartorius公司；Avanti J- 30I型落地式高速离心机,美国贝克曼公司；RV10型旋转蒸发仪，德国IKA公司；DW- 86L388A型低温冰箱，中国海尔集团。

实验所用肉制品均为市售，样品购回后统一均质制样后密封于玻璃器皿中于-18 ℃条件储存备用。实验所用器皿均经色谱纯正己烷清洗，所用试剂经过空白实验验证，无目标物带入。

为了评估该前处理方法的效果，先对市售样品进行多环芳烃含量测定实验，确定方法确认所用样品为阴性样品，按实验设计加入定量的标准溶液，涡旋混匀后，静置2 h待标液与样品充分混匀后，进行提取净化实验。根据加标样品中测得多环芳烃含量与实际加标量的比值获得回收率，以回收率的高低评价实验条件优化效果和方法的可行性。

食品中多环芳烃含量测定样品所用肉制品为市场随机挑选10个销售点同时采购腊肉、香肠、烤鸡肉串和烤羊肉串4种产品，共40批次样品，统一制样后密封于18 ℃条件储存备用。

1.2 标准溶液的配制

标准中间液的配置，乙腈为溶剂，将16种PAHs标准溶液(500 mg/L)稀释成10 mg/L的混合标准中间溶液，置于棕色容量瓶中，于-20 ℃避光保存。

标准工作液，待储备液恢复至室温后，分别移取一定量的标准中间液，用乙腈稀释至刻度，得到所需浓度的多环芳烃标液，上机制作标准曲线。

1.3 样品处理方法

准确称取均质试样5.00 g(精确至0.01 g),置于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL乙腈，涡旋2 min，加入4.0 g硫酸镁和1.0 g氯化钠，震荡5 min，超声提取20 min，以8 000 r/min离心5 min，移出上清液，残渣用5 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。将提取液转移至分散固相萃取管中(吸附剂为1 000 mg无水硫酸镁、200 mg C18E和100 mg PSA)涡旋2 min，再以8 000 r/min离心10 min，取2 mL经分散固相萃取后的液体于10 mL比色管中后，加入1 mL甲苯，迅速振摇混匀后全部吸入气密性注射器后迅速注入装有8 mL去离子水的离心管中，振摇后8 000 r/min离心5 min，置于-80 ℃冰箱中冷冻30 min，取上清液上机测定。

1.4 气相色谱条件

升温程序：初始温度150 ℃，保持0.8 min，以70 ℃/min升温至200 ℃，以2 ℃/min升温至225 ℃，以3 ℃/min升温至255 ℃，以2 ℃/min升温至300 ℃，以15 ℃/min升温至315 ℃，保持10 min，进样口温度320 ℃，分流进样，分流比为30∶1，线速度41.6 cm/s，传输线温度320 ℃，载气高纯He，典型色谱图见图1。

1.苯并[c]芴(BcL);2.苯并[a]蒽(BaA);3.环戊烯[cd]芘甲(5MC);6.苯并[b]荧蒽(BbF);7.苯并[k]荧蒽(BkF);8.苯并[j]荧蒽(BjF);9.苯并[a]芘(BaP);10.茚并[1,2,3-cd]芘(IcP);11.二苯并[a，h]蒽(DhA);12.苯并[g,h,i]苝(BgP);13.二苯并[a,i]芘(DiP);14.二苯并[a,e]芘(DeP);15.二苯并[a,l]芘(DlP);16.二苯并[a,h]芘(DhP)图1 16种欧盟优控多环芳烃标准溶液的离子流图Fig.1 Ion chromatograms of 16 EU priority PAHs

1.5 质谱条件

离子源温度300 ℃；电离方式电子轰击离子(EI)源；电子能量70 eV；全扫模式(Scan)及选择离子检测模式(SIM)16种PAHs的质谱参数见表1。

表1 16种欧盟优控多环芳烃保留时间、特征离子及结构式Tab.1 Retention time,target ions and structures of 16 EU priority PAHs

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

为了简化提取和优化过程，根据多环芳烃的差异，选用乙腈、丙酮和二氯甲烷作为提取溶剂，比较提取效果。分别用乙腈、丙酮和二氯甲烷对多环芳烃加标量为1.0 μg/kg的样品进行提取，经净化和萃取后上机测定目标物含量，根据16种欧盟优控PAHs回收率结果评价溶剂提取效果。实验结果如图2：从结果看，乙腈作为溶剂时，提取效果明显高于其他溶剂。本研究中分散固相萃取主要是除去干扰的基质成分，从而达到净化的效果。PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团，主要作用为极性相互作用及阴离子交换作用，可有效除去肉制品中的有机酸、脂肪和糖类物质；C18E吸附剂在硅胶上键合了十八烷基官能团，产生较强的非极性作用，对极性弱的脂肪酸、色素等大分子物质有较强的吸附效果；无水硫酸镁主要吸附样品中残留的水分，以保证PSA的吸附能力[20-21]。故最终选择提取效率好的乙腈作为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对16种欧盟优控多环芳烃的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of 16 EU priority PAHs with different extraction solvents

甲苯的密度比水小(ρ20 ℃=0.866 g·mL-1)，分散固相萃取液与甲苯混合后用玻璃注射器注入去离子水中，甲苯和乙腈的混合溶液以微球状分布于水溶液中，形成稳定的乳浊液(水- 乙腈- 甲苯)，萃取相之间以微球状接触大大增加萃取的接触面积，在短时间内达到液液萃取平衡，最后经高速离心得到上层萃取液甲苯，同时将在分散固相萃取时没有完全除去的净化盐溶入水中。从而，极大提高萃取速率和效果。

2.2 液液萃取条件优化

16种欧盟优控多环芳烃均为重质多环芳烃，常用甲苯为萃取溶剂。乙腈的凝固点温度为-45 ℃，而甲苯的凝固点温度是-95 ℃，因此，萃取离心后将试管-80 ℃条件下冷冻30 min，水和乙腈冷冻固化后，得到不含水的萃取液甲苯完全实现相分离，可以直接上GC/MS测定。用乙腈对多环芳烃加标量为1.0 μg/kg的样品进行提取，经分散固相萃取净化后，水- 乙腈- 甲苯萃取体系在室温、-20 ℃、-40 ℃、-80 ℃条件下冷冻30 min后上机测定目标物含量，根据16种欧盟优控多环芳烃回收率结果评价溶剂提取效果。图3是不同温度处理后16种欧盟优控多环芳烃回收率，可知-80 ℃条件下16种欧盟优控多环芳烃的回收率好，此外，在室温和-20 ℃条件下液液萃取，甲苯挥发性强，实验室弥漫着甲苯刺鼻味道，而且甲苯具有致癌性，对实验操作人员伤害大，-40 ℃条件下乙腈和甲苯都是液态没有实现完全相分离，用移液器移取甲苯速度慢，甲苯也有一定量的挥发。因此，-80 ℃条件冷冻，萃取液可以快速转移至进样瓶中密封上机测定，萃取效果好，回收率高，还避免溶剂影响实验人员身体健康。

图3 16种欧盟优控多环芳烃在不同温度冷冻时的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of 16 EU priority PAHs with different freezing temperature

2.3 色谱条件优化

16种欧盟优控多环芳烃均为重质多环芳烃(多于4环)，相对分子质量大，在传统非极性柱上无法完全分离，例如：苯并[b]荧蒽、苯并[j]荧蒽、苯并[k]荧蒽为同分异构体、苯并[a]蒽和环戊[cd]芘无法完全分开，影响定量结果；选用 J&W DB- EUPAH型色谱柱，所有峰形都是尖锐窄小，同分异构体基本达到基线分离，如图1。

2.4 方法线性范围和检出限的确定

7个质量浓度水平的系列混合标准工作液上机测定，结果见表2，16种多环芳烃在5～500 μg/L浓度范围内与峰面积呈现良好线性关系，相关系数均大于0.999，以信噪比(S/N)=3确定156种多环芳烃的检出限在0.1～0.5 μg/kg，以信噪比(S/N)=10确定16种多环芳烃的定量限在0.50～1.5 μg/kg。

表2 16种多环芳烃的线性方程、检出限和定量限Tab.2 16 EU priority PAHs equations of linear regression,LODs and LOQs

2.5 方法准确度和精密度的确定

对腊肉和烤肉串进行质量分数为0.5、1.5、5.0 μg/kg的加标回收实验，每个水平条件进行6组平行实验，通过回收率和精密度考察了方法的可行性，结果见表3。结果表明，16种多环芳烃的平均加标回收率范围为75.2%～114.2%，相对标准偏差为1.84%～7.57%(n=6)，方法的精密度和准确度均符合相关标准要求。

表3 方法的回收实验结果和精密度Tab.3 Recovery test results and precision of method

2.6 市售食品中多环芳烃检测结果

3 结 论

研究通过优化样品前处理方法，建立了分散固相萃取- 超低温液液萃取- 气相色谱质谱法测定烟熏及烧烤肉制品中16种欧盟优控多环芳烃分析方法。应用该方法对食品中16种欧盟优控多环芳烃进行检测，整个实验方法前处理简单、灵敏度高，方法学指标精密度、检出限满足国家标准和欧盟法规对16种多环芳烃的限量要求。应用该方法对40批次市售的腊肉制品和烤肉制品中的多环芳烃进行检测，发现部分腊肉和烤肉制品中多环芳烃含量超过GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》和欧盟法规No.835/2011的限量要求。希望有关部门督促相关食品企业对食品加工过程和工艺进行改进，开发绿色技术途径，减少有害物质的产生，让消费者吃得放心，促进传统熏烤肉制品行业更好发展。