人类胰腺导管腺癌三维类器官模型研究进展

耿宏智 苏力担卡扎·仇曼 迪力旦·纳斯尔 徐佳琪 陈启龙

1广西壮族自治区北海市合浦县人民医院肛肠科 536199；2新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆医科大学疾病和动物模型国家重点实验室，乌鲁木齐 830054耿宏智与苏力担卡扎·仇曼对本文有同等贡献

0 引 言

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDA）是一种最致命的恶性肿瘤，2019 年美国PDA发病率占胰腺癌发病率的90%以上，预计在2030 年美国胰腺癌病死率将仅次于肺癌[1-2]。在临床研究中化学药物治疗（化疗）被证明可明显提高PDA 患者的中位生存期，但患者接受传统化疗反应率仅为23%～31%[3-4]。如何提高PDA 化疗敏感性是一个亟待解决的临床难题。不幸的是PDA 化疗敏感性存在显著的异质性，常常导致不必要的治疗和额外的毒副作用。因此，在手术治疗效果有限的条件下，目前肿瘤精准治疗离不开两大关键性突破：①基因测序，通过分析大量癌症患者的基因异常数据，筛选出对化疗药物敏感的靶点，这一方法已成为现实。但其操作复杂，费用较高，难以做技术推广，故缺乏广泛的临床验证。②通过分析大量的能维持PDA 细胞体内特征的体外类器官模型，验证对化疗药物敏感的靶点，以此来预先识别哪些患者可接受或不接受化疗，使患者从化疗中获得最大收益。随着PDA类器官的发展，这一愿望也将得以实现。

1 既往细胞培养和动物模型药敏筛查的局限性

当前PDA 模型包括单层细胞株、患者来源的异种移植（patient-derived xenograft, PDX）和基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models,GEMMs）。癌症基因的细胞株实验已取得了进步，但原位移植无法预测治疗反应[5]，也不能涵盖患者生理相关的疾病状态[6]。为克服这一缺陷，提出了PDX模型和GEMMs 作为PDA 临床前模型[7]。PDX 生成PDA 需大量的组织，耗费6～12 个月来建立模型[8-9]，且费用非常昂贵。PDA GEMMs 也被作为基本生物学研究和临床前研究的平行系统[10]，其可准确模仿人类PDA 的病理生理特点，包括疾病入侵前的胰腺上皮内瘤变（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）[11-12]，但PDA 缺乏丰富的血管从而妨碍了药物输送[6,13-14]。此外，人类PDA 和GEMMs 均具有广泛的基质成分，减少肿瘤细胞的数量，导致难以分离和鉴定胰腺肿瘤组织中的上皮源性恶性细胞[15]。不论其来源如何，二维细胞培养不能复制肿瘤内细胞的异质性，缺乏复杂的细胞外微环境，生长为具有非自然悬浮和黏附力的单层细胞。虽然共培养和transwell 实验可解决其中一些问题，但二维细胞培养模型的生物转化可能受到限制[16]。

2 PDA 类器官模型的定义

面对上述缺陷，三维培养的组织开始改变这种局面，由PDA 干细胞派生的三维培养物被称为“类器官”[15]。首先，它必须包含一种以上来源器官的细胞类型；第二，表现出来源器官的一些特定功能；第三，细胞组织方式类似来源器官，这也意味着类器官以与原组织相似的方式在生成过程中建立组织器官的特点，类器官模型来自多能干细胞或祖细胞分化形成的孤立器官样组织，表现出多种细胞类型，自我组装形成一个体内器官的结构[17]。因此，Boj定义类器官为器官特异性细胞的集合。这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建[15]。Huang 等[17]采用电镜和免疫荧光染色法证明PDA 类器官的自我组装是以水凝胶为骨架，通过层粘连蛋白相接。

3 PDA 类器官模型的培养方法

PDA 类器官可由手术切除的人体肿瘤组织或内镜活检获取的转移肿瘤来生成，3 d 内可迅速生成，成功率为70%～80%，可低温储存，培养14～45 d即可用于药敏筛查。从活检建立类器官的能力将会促进更大范围PDA 患者人群的抽样，且重复采样可纵向追踪患者疾病的全过程[15]。1963 年Dobrynin[18]首先报道了二维单层细胞培养的人类PDA。之后Agbunag 等[19]和Pylayeva-Gupta 等[20]报告了胰腺三维类器官的培养技术，具体包括3 方面内容：①胰腺癌类器官的原代培养和长期扩增体系的建立。②胰腺癌类器官单层培养体系（二维）的建立。③胰腺癌组织三维类器官培养和分化方案的评估。

3.1 PDA 上皮类器官模型

2013 年Huch 等[21]首先报告了由裸鼠PDA 干细胞派生的三维培养类器官。2015 年Boj 等[15]首先采用人类胰腺肿瘤和裸鼠的胰腺正常上皮组织建立了类器官模型。他们在培养基中添加多种生长因子[如表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10,FGF10）]、形态因子（如Wnt 调节剂、Noggin）、抑制剂（如A83-01）和补充剂（如B27、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸）减少间质，以保证小鼠和人类胰腺导管细胞的增殖。

为避免对新鲜组织的需要，可通过诱导多能干细胞分化为胰腺外分泌细胞来建立类器官。Huang等[17]在水凝胶基质上的培养基中培养肿瘤细胞作为覆盖物。培养基中补充B27、抗坏血酸、胰岛素、氢化可的松、FGF2、Y267632 和全反式维甲酸（Rho 激酶抑制剂）。该法可实现器官的传代和低温保存。与Boj 等[15]的方法相反，上述媒介无需刺激Wnt 信号。利用该培养系统还可识别TP53 突变患者中转录因子SOX9 的胞质定位，而其定位与不良预后相关。但该模型的缺点之一是建模费用昂贵，特别是面对多种不同的生长因子必须添加不同的媒介。

3.2 PDA 类器官共同培养

上述PDA 类器官培养仅考虑了肿瘤的上皮腔室，因此必须添加来自间质的重要信号。将成纤维细胞和肿瘤细胞分别以体积比1∶2 接种于基质胶和培养基的混合物中培养，可能有助于克服这一问题。由于存在成纤维细胞，培养基仅需添加体积分数为10%的胎牛血清和EGF[22]。这种共同培养的类器官的另一个优点是其易被量化，可使用光学成像方法来筛选药物治疗后培养物内的代谢变化。

Tsai 等[23]从原发性肿瘤组织样本消化得到细胞成分，并于基质中培养，肿瘤细胞在基质凝胶中形成球体，周围环绕着肿瘤相关的成纤维细胞模拟PDA 肿瘤基质。将人类T 细胞加入共同培养物中，有效模拟了浸润性免疫细胞。这表明经典的肿瘤类器官模型可被调整至基质细胞，从而使肿瘤-微环境的复杂相互作用得以研究。

Li 等[24]报告了一种基于空气-液体界面的方法，该界面由含有胶原凝胶的跨孔组成，并与空气直接接触。在这种条件下，无需补充外源性因子即可生长来自小鼠胰腺的三维类器官。培养基中含有体积分数为20%的胎牛血清和质量浓度为50 g/ml 的庆大霉素。培养物可存活50 d，但不能传代。

4 其他的PDA 类器官模型

4.1 球体类器官

许多三维培养方法的缺点之一是很难将其扩大至高通量分析。一种更简单的三维培养方法是在甲基纤维素悬滴中创建胰腺癌细胞的球状体。甲基纤维素是惰性的，故不对细胞施加细胞外基质压力，而仅帮助细胞聚集。然后胰腺细胞可形成自身的基质，在不施加任何信号偏倚的情况下再现体内的情况。这种方法可在生理环境下更方便地筛选药物反应，还可检测不同条件下细胞内的分子[25]。

4.2 细胞外基质模型

PDA 患者预后差的原因之一是肿瘤通常在肿瘤转移后的晚期才被诊断出来。即使接受手术，患者也常会因转移性疾病复发。因此能在实验室中有效研究PDA 的侵袭和转移非常重要。在三维体外模型中正确模拟这种情况的关键是要有正确的细胞外基质组成、促结缔组织增生反应和细胞外基质硬度。通过改变模型中胶原蛋白的浓度，可获得不同的细胞外基质硬度，从而建立PDA 肿瘤内环境[26]。

4.3 微流体

另一种建立三维模型的方法是使用微流体技术和芯片类器官技术。有文献报道，在胶原包衣的HepaChip腔上生长的PDA 细胞，类似于在琼脂糖包衣的平板上生长的三维细胞；利用媒介电泳力将细胞组装于芯片中，灌注培养基后培养9 d，其优点是可快速建立细胞模型，并可模拟患者肿瘤的灌注率[27]。这使得筛选患者对不同化合物的反应变得容易，从而为患者制定临床个性化治疗方法提供了可能。

4.4 肿瘤切片模型

肿瘤切片生长的一种方法是先将患者手术切除的新鲜肿瘤标本转移至实验室的冷介质中（含胎牛血清和青/链霉素）；然后将肿瘤标本放入细胞外盐溶液中，例如含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、MgCl2、CaCl2、葡萄糖和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH7.4）；在无菌条件下将肿瘤标本切成薄片置于基膜上，膜上可预先涂上胶原蛋白；肿瘤切片可在添加胎牛血清、谷氨酰胺、NaHCO3、HEPES 缓冲液、L-胱氨酸和抗生素的培养基中生长，且可维持生存能力和结构长达6 d。肿瘤切片可能是筛选患者个性化治疗方案或更详细地检查PDA 肿瘤基质特征的有用方法，例如通过该法可识别免疫谱和改进靶向治疗[28]。

4.5 迷你胰腺

体外生长的胰腺三维模型是研究PDA 发展和胰腺疾病治疗的宝贵工具。其可进一步考虑其他细胞的作用，如内皮细胞、免疫细胞和神经元细胞[29]。建立人类或小鼠胰腺的体外模型时，来自间质的信号十分重要，祖细胞允许建立内分泌和外分泌腔室。复杂的胰腺类器官已可通过培养皿中诱导产生的祖细胞培养而来，细胞于分别添加FGF10、肝素、R-spondin-1 蛋白、EGF 和Rho 相关蛋白激酶抑制剂Y-27632 的基质中生长。当暴露于上述因素时，特别是在诱导FGF 和Notch 信号后，祖细胞分化、重新排列成胰腺结构。类器官再现了胰腺的发育，细胞形成了一个极化导管网络，顶端有腺泡细胞，中央有内分泌细胞[30]。

5 PDA 类器官模型的侵袭性和稳定性

已有研究者通过免疫组化、免疫荧光、蛋白质质谱分析和基因热图等基础实验技术验证PDA 类器官模型的侵袭性和稳定性[15,17]。PDX 涉及将人类组织或细胞植入人类或免疫缺陷的啮齿动物体内，通过类器官移植进一步完善肿瘤侵袭和转移的研究方法。由于皮下异种移植通常不能准确反映癌症的侵袭或转移，因此原位移植十分重要。

PDA 类器官的原位模型由类器官发展而来，其可产生均匀的肿瘤，依赖于癌细胞的转移潜力，这些肿瘤可靠地生长和转移。PDA 原位移植肿瘤类器官模型可重复早期局部侵袭性PanIN 样病灶和转移性肿瘤形成的全光谱过程，且培养PanIN 来源的细胞将能评价这些早期胰腺癌假定的生物标志物。在疾病进展期，裸鼠胰腺类器官全面的转录组和蛋白质组分析结果显示基因和通路发生了改变，这些蛋白质在人体组织的改变表明类器官模型可能会发现这种致命的恶性肿瘤的特征[15,17]。Boj 等[15]也分析了正常小鼠的转录组和蛋白质组，结果表明PanIN 和PDA 类器官培养可识别特定的癌变前和恶性疾病的变化。在此之前，识别和比较肿瘤与正常组织的这些变化一直是项困难的工作，因为主要的基质细胞在原发胰腺肿瘤中缺乏一个允许正常细胞扩张的体外模型系统。值得注意的是类器官移植模型移植了一个独特的组织模式，包括类似早期肿瘤疾病的阶段，这有别于传统的移植模型，快速生成侵入性肿瘤而无中间阶段。此外，其他移植模型未涵盖基膜丰富而血供少的微环境，导致混淆胰腺癌患者的治疗反应。相比之下，类器官移植模型可准确模仿这种促进结缔组织增生性的反应和其他人类疾病的生理相关方面[15]。类器官有潜力模拟人类疾病的发展，这项技术使研究者们能在培养皿中造出简单的组织模型，无需在人体进行试验即可探索复杂人体组织的问题。类器官还具有潜在的药物测试能力，未来甚至可能用于器官替换。

肿瘤精确建模的一个关键挑战在于捕捉同质和异形细胞间相互作用的三维组织微环境。类器官模型是研究肿瘤进化和异质性的一个简单模型系统，其可连续操作，观察到肿瘤发展的整个过程，因此正常组织和肿瘤组织类器官可作为一个理想的测试平台，探讨肿瘤进化与基因组异质性的机制。由正常胰腺培养的类器官具有稳定的基因，而培养的肿瘤组织如实捕获了患者肿瘤的遗传特征，类器官移植模型将促进体内研究，但在传统情况下胰腺癌的GEMMs 是不可用的。原位移植也可在肿瘤表型和/或基因型特征确定和/或处理后进行，PDA 类器官模型可移植至小鼠，它们促进组织增生反应的生成并发展为浸润性癌[15]。由裸鼠和人类PDA 发展的一个全面的三维细胞培养模型将促进新PDA 驱动基因的研究、化疗治疗和诊断，同时PDA 类器官模型也为患者个体化治疗提供了一个实验平台。

6 PDA 类器官模型应用于化疗药敏筛查

Frappart 等[31]通过免疫组化和分子表征技术系统比较了PDX 模型和患者类器官来源的异种移植瘤模型。随后建立了药物检测平台，并进行了体内验证，结果表明在类器官中进行小规模药物筛选似乎是一种可行、稳健且易于处理的疾病建模方法，可在日常临床常规中有效地进行反应预测。

Tiriac 等[32]构建了一个PDA 患者来源的类器官文库，测序分析结果显示PDA 类器官和相应的肿瘤组织在基因突变范围方面具有高度一致性。总的来说，PDA 类器官能再现原始肿瘤。同时，他们采用多环腺苷三磷酸腺苷法检测了66 例PDA 类器官对常见化疗药物（吉西他滨、nab-紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂）的药物敏感性，以及对患者反应的交叉对照，结果表明多环腺苷三磷酸腺苷法具有较高的预测价值[32]。该研究结果还表明，特异性遗传特征与患者对治疗的反应之间不存在相关性。相反，基于PDA 类器官药理干扰的mRNA 标记可成功应用于患者，以区分对传统疗法有反应的患者和无反应的患者。特别是使用剂量响应曲线和曲线下面积来评估个体药物的反应[32]。这种模拟疾病的类器官可作为一种可选择的药物测试系统，不仅可更好地解决患者对于药物的反应效果，还可减少动物实验的次数。使用类器官模型大范围筛查不可预知化合物的反应时，多种组合和剂量的药物也可同时进行测试，且无需先验性地理解潜在的分子机制，可直接进行化学敏感性测试，从而缩短治疗时间。PDA 类器官作为一种体外活体生物库，多种不同组合的药物和剂量可同时用于药敏筛查，这将有助于建立不同的化疗档案，开发新的化疗方案用于指导临床患者的个体化治疗。在实验研究中，这种方法可能适用于建立个体化患者模型响应的档案，以探讨PDA 类器官模型对临床癌症治疗的指导作用。

7 PDA 类器官的局限性

PDA 具有自身的局限性，其无血管、淋巴、纤维组织、免疫细胞等间质成分，肿瘤派生的类器官在体外可存活9～12 个月，离开培养液则不能生存[15]。各个实验室三维类器官基膜培养所使用的试剂不同，最好的培养方法有待认定。因此，从基因和细胞角度考虑肿瘤的复杂性，以及肿瘤实质和邻近间质固有的非均质性，肿瘤仿真实验是一项艰巨的任务。

8 展 望

目前，三维类器官模型的实验平台尚处于“婴儿期”，其可促进药物或化学品的系统性、重复性和定量研究。在发展类器官模型时，首要目标是通过复杂的培养系统再现人体生理相关功能。三维生物打印的类器官模型提供了令人振奋的前景，其支持可复制的、自动化的复杂活体组织生产。类器官因其固有的空间和化学复杂性可能用于筛选新化合物或预测毒性。器官可能被重新创建，其与原生组织的相似性使其可优先应用于毒性测试、疾病或肿瘤模型[33]。此外，有望从PDA 的分子病理基因分型[34]和基因分子亚组分型[35]的角度，进一步探索PDA 产生耐药的分子病理学机制。同时也期待着融合瘤类器官的建立，融合瘤类器官是指融合正常组织来源与血管和神经相连的肿瘤类器官。不同于仅仅关注单个肿瘤器官的细胞-细胞关系，多个肿瘤类器官将为器官-器官相互作用提供一种见解，这有助于对肿瘤转移的途径进行建模[36]。幸运的是，上述两种设想方法涉及的细胞负载纤维和三维网格可能有助于克服类器官的血管化问题[37]。随着培养方法的改进，对类器官内部成分的进一步分析以及与其他技术的结合，相信类器官将推进和拓宽人们对肿瘤学的理解，未来可作为临床常规诊断治疗的一部分，伴随疾病的诊疗全程，为研究PDA 微环境相互作用、识别新的生物标志物和促进药物敏感性研究提供了一个实用的工具，从而达到胰腺癌个体化和精准医学治疗的目的。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突