超声波辅助提取长裙竹荪抑菌物质工艺优化及其抑菌活性研究

张永杰，江丽慧，潘明，唐甜甜，陈存，张薇*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.成都师范学院化学与生命科学学院，成都 611130)

竹荪为鬼笔目、鬼笔科、竹荪属的大型食用菌[1]。竹荪具有很高的营养价值，其子实体中含有21种氨基酸以及多种维生素[2]。竹荪子实体提炼出的竹荪精是一种味道极其鲜美的纯菌类调味品，因富含氨基酸，放入食材中非常美味。竹荪除可提取调味品外，对食品防腐也具有奇效，“与肉共食，味鲜防腐”，在夏季，加入竹荪的煮熟菜肴可以较长时间不腐败变质[3]，这说明竹荪加工的调味品可能具有防腐功效，这是其他调味品所不具备的优势。蓝蔚青等[4]和郝景雯等[5]的研究表明，竹荪提取液对食源性病原菌，如大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌与单增李斯特菌均有抑菌作用。然而，竹荪作为天然抑菌剂，目前对其抑菌效果的研究主要集中于食源性病原菌，对果蔬致腐菌抑菌效果的研究尚少。胡萝卜软腐欧文氏菌和层出镰刀霉是两种常见的果蔬致腐菌，能够造成芥菜软腐病和枸杞鲜果病害[6-7]。因此，本研究以这两种果蔬致腐菌为供试菌，为进一步研究竹荪提取液对果蔬致腐菌的抑菌作用提供了参考。

抑菌物质的提取方法有许多，其中，超声波提取法因效率高、穿透能力强，能使细胞发生物理性破裂而受到重视。关于超声波提取竹荪抑菌物质的研究虽然已出现，然而尚未优化提取试剂和超声波提取参数，如料液比、功率和时间等。基于此，本研究以长裙竹荪为研究对象，针对两种常见果蔬致腐菌(层出镰刀霉、胡萝卜软腐欧文氏菌)，采用3种常用提取剂(水、90%乙醇、乙酸乙酯)进行提取，筛选出最佳提取剂和敏感性更高的果蔬致腐菌，并采用单因素和正交试验对超声波辅助提取法参数进行优化，得到最佳工艺，以期为竹荪用于开发天然绿色抑菌剂提供参考，并推广其在果蔬防腐领域的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原材料

长裙竹荪：2019年7月购于宜宾市长宁县；马铃薯：2019年7月购于自贡市汇东农贸市场。

1.1.2 供试菌株

大肠杆菌(Escherichiacoli)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、层出镰刀霉(Fusariumproliferatum)：均由四川轻化工大学生物工程学院实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理

将长裙竹荪置于60～70 ℃的烘箱中，烘干至恒重。采用植物粉碎机粉碎，粉末过80目筛后得到长裙竹荪干粉，备用。

1.2.2 最佳提取剂的筛选

分别以水、90%乙醇、乙酸乙酯为提取剂，采用超声波辅助提取法得到长裙竹荪提取液。采用抑菌圈法分别测定3种提取剂下得到的提取液对3种供试菌种(大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉)的抑菌效果，其中大肠杆菌为对照菌种。前人的研究表明，长裙竹荪提取液对大肠杆菌具有很好的抑菌效果，因此选择大肠杆菌作为对照菌种。以抑菌圈直径为指标，研究3种提取剂对长裙竹荪提取液抑菌效果的影响，得到最佳提取剂，每个试验设3个重复。

1.2.3 对长裙竹荪提取液最敏感果蔬致腐菌的筛选

以乙酸乙酯为提取剂，采用超声波辅助提取法得到长裙竹荪提取液。采用抑菌圈法测定乙酸乙酯作为提取剂时，长裙竹荪提取液对3种供试菌种(大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉)的抑菌效果，其中大肠杆菌为对照菌种。以抑菌圈直径为指标，研究3种菌对长裙竹荪提取液敏感性的高低，并得到敏感性最高的菌种。评判标准见表1，每个试验设3个重复。

表1 菌种抑菌敏感性的判定标准Table 1 The criteria for determining antibacterial sensitivity of strains

1.2.4 超声波辅助提取试验优化

通过前期预试验及考虑原材料成本，确定菌液的浓度为10 μL，抑菌物质添加量为5 μL，培养时间为15.5 h时，菌液浓度变化最明显。同时发现，采用吸光度法得出的结果更加准确直观。

1.2.4.1 单因素选择

在菌液添加量为10 μL，抑菌物质添加量为5 μL的条件下，设置20，30，40，50，60 min 5个不同的超声时间，350，420，490，560，630 W 5个不同的超声功率，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)5个不同的料液比进行单因素试验，研究 3个主要影响因素：超声时间、超声功率、料液比对长裙竹荪提取液抑菌效果的影响[8-10]。

1.2.4.2 正交优化超声波辅助提取试验

基于单因素试验结果，通过正交优化试验来确定超声波提取的最佳工艺。以15.5 h时间段的吸光度为指标，反映出菌悬液浓度，进而比较长裙竹荪提取液的抑菌效果，得到最佳提取条件。选取影响显著的3个因素：超声时间(A)、超声功率(B)、料液比(C)进行正交优化试验，试验因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素和水平设计Table 2 The factors and levels design of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 最佳提取剂的筛选

不同试剂对提取物成分及浓度有重要影响。对于不同的提取对象，最佳提取剂也不一定相同。已有研究表明，水、90%乙醇和乙酸乙酯被用于提取长裙竹荪抑菌物质[11-12]。因此，本试验选择这3种试剂来提取长裙竹荪抑菌物质，筛选出最佳提取剂。根据前人文献可知，本试验水提采取的料液比是1∶20 (g/mL)，90%乙醇采用的料液比为1∶10 (g/mL)，乙酸乙酯采用的料液比为1∶20 (g/mL)。

表3 3种提取剂提取的长裙竹荪提取液对3种菌抑菌圈直径的影响Table 3 The effects of Dictyophora indusiata extraction solution extracted by three extractants on the inhibition zone diameters of three bacteria

图1 3种提取剂提取的长裙竹荪提取液对3种菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effects of Dictyophora indusiata extraction solution extracted by three extractants on three bacteria

由表3和图1可知，乙酸乙酯提取的长裙竹荪液对胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉两种抑菌抑菌圈直径均最大，分别为11.5 mm和16.6 mm，而对照组大肠杆菌的抑菌直径为11.2 mm。水作为提取剂获得的粗提物抑菌效果均最弱，胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉两种菌的抑菌圈直径分别为6.0 mm和9.5 mm，而对照组大肠杆菌的抑菌圈直径仅为6.1 mm。长裙竹荪的90%乙醇提取物抑菌效果介于乙酸乙酯和水之间，对胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉的抑菌圈直径分别为9.9 mm和14.7 mm，大肠杆菌的抑菌圈直径为9.5 mm。因此表明，长裙竹荪乙酸乙酯提取物对3种供试菌的抑菌效果最好。由此得出，当乙酸乙酯作为提取剂时，能更好地破坏长裙竹荪的结构，促进长裙竹荪中抑菌物质的提出，故选择乙酸乙酯作为长裙竹荪的提取剂进行进一步试验。

2.2 对长裙竹荪提取液最敏感果蔬致腐菌的筛选

不同果蔬致腐菌对同一种抑菌物质表现出的敏感性具有差异性。李雯霞等[13]发现野油菜黄单胞菌、产黄青霉、灰色葡萄孢霉等果蔬致腐菌对芍药花提取物表现出的敏感性具有很大差异性。因此，本试验选择胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉两种果蔬致腐菌，研究其对长裙竹荪提取液的敏感性大小，筛选出最敏感的致腐菌。2.1中用乙酸乙酯提取时，采用的料液比为1∶20 (g/mL)，得到的抑菌圈直径均属于低度敏感菌范围，因此将料液比1∶20 (g/mL)扩大1倍为1∶10 (g/mL)。

表4 3种菌对长裙竹荪提取液的敏感性大小 Table 4 The sensitivity of three bacteria to Dictyophora indusiata extraction solution

图2 3种菌的抑菌圈直径大小Fig.2 The inhibition zone diameters of three bacteria

由表4和图2可知，以乙酸乙酯为提取剂时，层出镰刀霉培养基中的抑菌圈直径最大，其平均抑菌圈直径菌大于18 mm，为19.1 mm。对长裙竹荪提取液表现为高度敏感。胡萝卜软腐欧文氏菌培养基中的平均抑菌圈直径与层出镰刀霉的相差不大，为18.2 mm，对长裙竹荪提取液表现为高度敏感，其中大肠杆菌作为对照，敏感性最低，抑菌直径为9.4 mm。结果表明，长裙竹荪中提取出的抑菌物质对胡萝卜软腐欧文氏菌和层出镰刀霉的生长代谢抑制效果都非常好。然而，层出镰刀霉是真菌，不太适合用于液体培养，故本项目选择更适合用于液体培养的细菌，以胡萝卜软腐欧文氏菌作为目的菌进一步试验。

2.3 超声波提取试验结果

2.3.1 单因素试验及其分析

2.3.1.1 超声时间对长裙竹荪提取液抑菌效果的影响

不同超声时间对抑菌物质的提取有重要影响，每种天然提取物都有其最适的超声提取时间。本试验以乙酸乙酯为提取剂，胡萝卜软腐欧文氏菌为目的菌，测定了不同超声时间对长裙竹荪抑菌物质的提取和抑菌效果的影响，结果见图3。

图3 超声时间对菌悬液吸光度的影响 Fig.3 The effect of ultrasonic time on the absorbance of bacterial suspension

由图3可知，菌悬液的浓度随时间的延长不断变化，总体呈先降低后升高的趋势，当超声时间达到30 min时，菌悬液的浓度最低，对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制效果最好。张子龙等[14]的研究发现，茉莉花茶中抑菌物质的提取浓度随着超声时间的延长呈先上升后降低的趋势，在20 min时，抑菌物质的提取浓度最大，说明超声时间过短或过长均不利于抑菌物质的提取。超声时间过短，导致提取不充分；超声时间过长，导致抑菌成分被破坏，因此，当菌悬液浓度在超声时间30 min达到最低后再延长超声时间毫无意义。

2.3.1.2 超声功率对长裙竹荪提取液抑菌效果的影响

超声波压强会对原料产生空化作用，采用超声波提取天然抑菌物质时，抑菌物质浓度往往会随着超声功率的提高呈现先上升后降低的趋势。曹小燕等[15]的研究表明，油菜籽粕中提取的抑菌物质浓度随着超声功率的提高呈现先上升后降低的趋势，与本试验的结果一致。

图4 超声功率对菌悬液吸光度的影响Fig.4 The effect of ultrasonic power on the absorbance of bacterial suspension

由图4可知，随着超声功率的升高，菌悬液的浓度先降低后升高，当超声功率达到490 W时，菌悬液的浓度最低，长裙竹荪提取液中抑菌物质的浓度最高，对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制效果最好，之后菌悬液的浓度逐渐升高。出现此情况的原因可能是超声波具有较强的机械剪切作用，当超声功率过高时，抑菌物质的结构被破坏，导致抑菌物质的提取量下降。因此，超声功率选择490 W为宜。

2.3.1.3 料液比对长裙竹荪提取液抑菌效果的影响

料液比会对抑菌物质的提取产生直接影响，从而间接影响菌悬液的浓度。由表5可知，在一定范围内菌悬液的浓度随着料液比的增大而降低，当料液比达到1∶20 (g/mL)后，菌悬液浓度随着料液比的增大呈缓慢升高的趋势。出现此情况的原因可能是：一定量的长裙竹荪粉末，在一定范围内，当液体增加时，与液体的接触面积增加，有利于抑菌物质的溶出。当液体量过多时，液体会吸收超声波的辐射，从而使细胞破壁的作用降低，抑菌物质的提取趋于稳定。因此，料液比选择1∶20 (g/mL) 为宜。

表5 料液比对菌悬液吸光度的影响Table 5 The effect of solid-liquid ratio on the absorbance of bacterial suspension

2.3.2 正交优化结果

在单因素试验的基础上，选取料液比、功率、时间进行3因素3水平的正交试验，以获得最佳提取条件。正交试验的结果及分析见表6和表7。

表6 正交组无粗提物菌液对照结果Table 6 The control results of bacterial solution without crude extract in orthogonal group

表7 正交试验结果Table 7 The results of orthogonal test

由表6可知，未加入长裙竹荪提取液时，3次测定菌悬液的吸光度值及其平均吸光度值。由表7中的极差R值可知，R值越大，该因素的水平变动对试验结果的影响越大，影响长裙竹荪抑菌物质提取的3个因素顺序为料液比(C)>超声时间(A)>超声功率(B)。因此，根据单因素和正交试验结果，综合考虑，超声波辅助提取长裙竹荪抑菌物质的最优方案为A3B3C2，即超声时间40 min，超声功率560 W，料液比1∶20 (g/mL)。

3 结论

此项目针对两种常见的果蔬致腐菌(胡萝卜软腐欧文氏菌、层出镰刀霉)，采用3种提取剂进行提取。发现在应用3种提取剂的情况下均能提取出抑菌物质，且对两种果蔬致腐菌和大肠杆菌均有抑制效果，其中乙酸乙酯为最佳提取剂，同时，胡萝卜软腐欧文氏菌和层出镰刀霉较大肠杆菌均对长裙竹荪乙酸乙酯提取液表现更为敏感。长裙竹荪提取液对果蔬致腐菌的抑制机理尚不明确，后期可从细胞壁和细胞膜、蛋白质和遗传物质及呼吸代谢几个方面探究抑制机理。

以乙酸乙酯为提取剂，检测细菌胡萝卜软腐欧文氏菌菌悬液浑浊度来反映抑菌效果，通过单因素和正交优化试验对长裙竹荪提取条件进行优化，优化提取条件为：超声时间40 min，超声功率560 W，料液比1∶20 (g/mL)，在此条件下长裙竹荪提取液的抑菌效果最好，且影响抑菌效果因素的主次关系依次为料液比(C)>时间(A)>功率(B)。本研究未考虑到温度、pH等条件对该提取方法的影响，后期可进一步研究温度、pH等条件对该提取方法的影响。再者，对长裙竹荪其他部位，特别是废弃部分进行更高效的开发利用，以求开发天然防腐剂，并作用于果蔬甚至是肉质品等食品领域，既能抑制果蔬和肉制品等食品腐烂，又能作为调味品应用于果汁、果酱、水果沙拉、肉制品等食品中增加鲜味，兼具防腐抑菌和调味功能。