慢性前列腺炎模型筛选及其肾功能评价

王文地，郑玉婷，于冰莉，崔 洁，侯俊玲，3*，王文全，，3*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 102488)

慢性前列腺炎(CP)在成年男性中的患病率接近50%[1]，临床表现为盆腔或生殖器疼痛、下尿路刺激和梗阻症状、精子质量降低等[2-5]。国内外研究者已建立的CP模型有微生物致病模型、化学刺激模型、免疫诱导模型、激素诱导模型和老龄动物自发模型等[6]。其中化学刺激模型操作方便，在国内外研究中使用广泛。

1 仪器与材料

1.1仪器 3K15型台式离心机(德国Sigma公司)；FA2004N型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；120型全自动生化仪(日本东芝公司)；TEK-Ⅱ mini型血细胞分析仪(江西特康公司)；Multiskan FC型酶标仪(上海赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.2试药 角叉菜胶(批号1202A053)，北京索莱宝科技有限公司；消痔灵注射液(批号18103006，规格：10 mL∶0.4 g)，吉林省集安益盛药业股份有限公司；注射用青霉素钠(批号180601)，华北制药集团动物保健品有限责任公司；氯化钠注射液(批号SD19091407，规格：500 mL∶4.5 g)，山东华鲁制药有限公司；尿素氮、肌酐和葡萄糖(批号分别为20190701、20190901、20190901)，均购自北京北检新创源生物技术有限公司。试剂盒：前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺素E-2(PGE-2)，γ干扰素(IFN-γ)，白细胞介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)(批号分别为20190609-30702A、20190609-30581B、ml064291、ml064292、ml002859)，均购自上海酶联生物科技有限公司。中性甲醛溶液(批号20181212)，北京益利精细化学品有限公司；水合氯醛(批号20181017)，天津市福晨化学试剂厂。

1.3动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量为280～320 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2019-0010。大鼠饲养在(22±2) ℃、相对湿度为55%±5%的层流气流室中，每12 h交替明暗，标准饮食饮水，于常规条件下适用性饲养1周后用于实验。

2 方法

2.12种造模方法稳定性比较实验 将24只SD雄性大鼠适用性饲养1周后随机分为3组，分别为假手术组、角叉菜胶组和消痔灵组，每组8只，分笼喂养。在造模手术当天腹腔注射100 g·L-1的水合氯醛3 mL·kg-1，待大鼠麻醉后于下腹纵向开约1 cm切口，暴露膀胱背侧前列腺及精液囊。假手术组大鼠立即缝合肌肉皮肤；角叉菜胶组大鼠给予10 g·L-1角叉菜胶生理盐水，按照每只每侧0.05 mL注入两侧精液囊内，缝合肌肉皮肤；消痔灵组大鼠给予消痔灵注射液，按照每只每侧0.06 mL注入大鼠前列腺两背侧叶，缝合肌肉皮肤。术后各组大鼠按照剂量25万u·kg-1肌肉注射青霉素，每日1次，连续3 d。所有大鼠造模术后连续常规饲养7周，每周测量体质量并记录。在术后第1、3、5周禁食12 h后眼眶采血，术后第7周禁食12 h后腹主动脉取血，处死大鼠，仔细采集前列腺、肾、睾丸、脾和胸腺。计算各脏器指数，脏器指数=脏器质量÷体质量×100%。所有血样静置2 h后以4 000 r·min-1离心10 min，收集血清，于-80 ℃储存，根据PSA、PGE-2的Elisa试剂盒说明书检测各组大鼠血清中各指标的含量。

2.2角叉菜胶致大鼠CP模型评价实验 将16只SD雄性大鼠适用性饲养1周后随机分为假手术组和角叉菜胶组，每组8只，分笼饲养。角叉菜胶组与2.1项下角叉菜胶组造模方法一致。在术后第1、3周禁食12 h后眼眶采血，术后第5周禁食12 h后腹主动脉取血，处死大鼠并采集前列腺及肾，计算脏器指数。采集的全血样本，用三分类血细胞分析仪检测各组大鼠全血中白细胞计数(WBC)。血清根据PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ的Elisa试剂盒说明书检测各组大鼠血清中各指标含量，并用全自动生化仪检测血清中CREA、UREA和GLU的含量。

3 结果

3.12种造模方法维持时间比较 本文对角叉菜胶组和消痔灵组模型进行了比较研究，以PSA和PGE-2为指标，对比造模后各时间点的指标水平，见表1。

当机体发生炎症时，炎性因子PGE-2表达升高，促进血管扩张，使毛细血管的通透性增大，引起疼痛等症状。同时，由于生理屏障被破坏，PSA大量进入血液循环中[15-16]。由表1可知，角叉菜胶组血清PSA及PGE-2水平造模后第1、3、5周均显著高于假手术组，造模后第7周，PSA及PGE-2水平与假手术组比较差异无统计学意义，角叉菜胶组造模完成后1周即可显现血清炎症现象，第7周血清炎症恢复正常，该模型维持时间至少4周。

表1 2种模型的检测指标比较Tab.1 Comparison of detection indexes between the 2 models

消痔灵组血清PSA及PGE-2水平在造模术后第1周与假手术组比较差异无统计学意义，在造模后第3周PSA及PGE-2水平与假手术组比较显著升高，在造模后第5周血清PSA水平仍显著高于假手术组，而血清PGE-2水平与假手术组比较差异无统计学意义，PSA及PGE-2水平在造模术后第7周与假手术组比较差异均无统计学意义，表明消痔灵组造模完成3周后造模成功，第5周起血清炎症情况逐渐恢复，该模型至少能维持2周。

造模手术后第7周脏器指数检测结果显示，角叉菜胶组和消痔灵组的前列腺指数均显著高于假手术组(P<0.05)，对各组肾、睾丸、脾和胸腺指数进行分析，2组与假手术组比较差异均无统计学意义，表明2种造模方法对前列腺指数有显著升高的作用，维持时间较长，但对其他脏器影响均较小，且角叉菜胶组模型成模时间更早，维持时间更长。

3.2角叉菜胶致大鼠CP模型评价

3.2.1相关炎症因子考察 根据前期实验中角叉菜胶诱导模型维持时间结果及对前列腺炎治疗药物相关研究中灌胃时间的综合考虑，取造模后第5周的大鼠，检测其他相关炎症因子，见表2。TNF-α和IFN-γ是促炎性细胞因子，均由活化T细胞产生，前者刺激白细胞合成白细胞介素1 (IL-1)、IL-6和白细胞介素8 (IL-8)等细胞因子，促进炎症反应；后者促进免疫细胞的增殖和活化[17]。WBC常用来间接反映炎症的严重程度，在炎症反应过程中，白细胞分泌释放IL-6，促进T细胞的增殖[18-19]。

表2 角叉菜胶诱导模型相关炎症因子检测结果Tab.2 Results of the inflammation related indexes of carrageenan-induction model

由表2可知，角叉菜胶组WBC结果显著高于假手术组(P<0.05)，血清中炎症相关因子PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均显著提高。对前列腺指数进行检测，角叉菜胶组大鼠前列腺指数高于假手术组，表明该模型能引起相关炎症因子表达量升高，且能维持到造模后第5周。角叉菜胶组肾指数与假手术组比较差异无统计学意义。

3.2.2肾功能影响检测 对造模后不同时期的各组大鼠血清中肾功能指标进行检测，分析造模对大鼠肾功能的影响趋势，见表3。由表3可知，造模后第1周，角叉菜胶组血清CREA及GLU水平与假手术组比较差异无统计学意义，UREA水平较假手术组显著升高(P<0.05)；造模后第3周，角叉菜胶组大鼠CREA水平与假手术组比较差异无统计学意义，UREA水平显著高于假手术组，GLU水平显著低于假手术组；造模后第5周，角叉菜胶组大鼠3个肾功能因子水平与假手术组比较差异均无统计学意义，表明该模型造模后对大鼠血清中CREA水平无影响，在造模后第1、3周UREA均升高，在造模后第5周，该影响恢复至正常水平；对于GLU水平，角叉菜胶组在造模后第3周显著低于假手术组，造模后第5周差异恢复。

表3 角叉菜胶诱导模型肾功能影响检测结果Tab.3 Results of renal function of carrageenan-induction model

4 讨论

CP作为一种慢性病，病程缠绵，治疗周期长，该疾病带来的疼痛和经济负担对患者的心理状态和生活质量产生极大影响[20-22]。研究CP动物模型作为进行相关治疗研发的基础，具有重要的社会和经济价值[23]。

本实验对化学刺激模型中常用的2种致炎剂诱导模型的稳定性进行了对比。与假手术组比较，角叉菜胶组从造模后第1周起PSA与PGE-2水平显著提高(P<0.05)，造模后第7周恢复至假手术组水平(P>0.05)。与假手术组比较，消痔灵组从造模后第3周开始PSA与PGE-2水平显著提高(P<0.05)，其中PSA在第7周恢复至假手术组水平(P>0.05)，PGE-2在造模后第5周与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。考虑到消痔灵与角叉菜胶注射液质地不同，吸收程度和在组织内作用快慢存在差异，消痔灵诱导该模型成模时间较角叉菜胶晚，维持时间短，因此认为角叉菜胶造大鼠CP模型更优。

造模后第7周取材各脏器，角叉菜胶组和消痔灵组前列腺指数均显著高于假手术组(P<0.05)，其他脏器指数两模型组与假手术组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对两模型组前列腺指数在第7周未降低至假手术组水平，考虑可能是由于炎症导致前列腺组织纤维化难以在短时间内恢复。其他各脏器指数在造模后第7周时与假手术组比较差异无统计学意义，考虑是否在造模期间产生差异，第7周时恢复的可能。本文结合临床上CP与慢性肾脏病间出现的特点[24-25]，考虑到肾脏作为多种药物或其代谢产物滤过、重吸收和排泄的场所[26]，在药物筛选中肾毒性多作为重点考虑的研究对象，设计实验对角叉菜胶诱导的大鼠CP模型中各时间点的肾功能指标进行监测[27]。结果表明，造模可升高血清UREA(P<0.05)，降低GLU(P<0.05)，但在造模后第5周检测该影响消失，且肾指数也与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。本实验认为，灌胃第4周可作为药物筛选和药物肾毒性考察的综合考量点。

本实验可为CP与慢性肾脏病结合的临床病理综合征的模型研究奠定基础，并对基于动物模型的药物肾毒性考察中给药周期的确定提供理论依据。