HPLC法测定感冒灵胶囊中5种有效成分的含量

沈晓燕，刘晓瑜，邱海强

(无锡市药品安全检验检测中心，江苏 无锡 214028)

感冒灵胶囊由三叉苦、金盏银盘、野菊花、岗梅、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因等组成的复方制剂，具有解热镇痛之功效，用于感冒引起的头痛、发热、鼻塞、流涕、咽痛等症状[1]。其中岗梅及野菊花的有效化学成分均含有绿原酸，野菊花中另一种有效成分为蒙花苷。其质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十三册，原标准中仅采用薄层色谱(TLC)法鉴别对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏及咖啡因，采用滴定的方法对乙酰氨基酚的含量进行控制，专属性差、准确度低。《国家药品标准》WS3-B-2631-97-4中采用高效液相色谱(HPLC)法分3个系统分别对对乙酰氨基酚、咖啡因及马来酸氯苯那敏含量进行测定，方法准确度提高，但是不够快速简便。为了完善其质量标准，笔者参考相关文献[2-8]，建立HPLC法同时测定感冒灵胶囊中对乙酰氨基酚、绿原酸、咖啡因、马来酸氯苯那敏及蒙花苷5种有效成分的含量。

本方法通过色谱条件的优化，采用双波长梯度洗脱的方式同时测定感冒灵胶囊中5种有效成分的含量，简便快速，高效可行，为感冒灵胶囊的质量控制提供了一个参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；超声清洗器(德国Elma公司)；电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；酸度计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试剂与药品

1.2.1 对照品 绿原酸(批号：110753-201817，纯度：96.8%，)、咖啡因(批号：171215-201211，纯度：99.9%)、蒙花苷(批号：111528-201710，纯度：96.6%)、对乙酰氨基酚(批号：100018-201610，纯度：99.9%)、马来酸氯苯那敏(批号：100047-201507，纯度：99.7%)均来源于中国食品药品检定研究院。

1.2.2 供试品 市售感冒灵胶囊3批(广西某药业股份有限公司，批号：1711091、1910007、1909002)。

1.2.3 试剂 甲醇(HPLC级，默克公司)；冰醋酸(HPLC级，阿拉丁试剂)；三乙胺(HPLC级，阿拉丁试剂)；水为超纯水。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-4%冰醋酸(用三乙胺调节pH值至3.0)，按表1梯度进行梯度洗脱；进样量：10 μL；检测波长：绿原酸与蒙花苷为334 nm，马来酸氯苯那敏、对乙酰氨基酚与咖啡因为260 nm；柱温：35 ℃。绿原酸、咖啡因、蒙花苷、马来酸氯苯那敏和对乙酰氨基酚5个成分的峰理论板数均不低于3 000，与相邻峰的分离度均大于2.0(见图1)。

表1 梯度洗脱条件

A.混合对照溶液；B.供试品溶液；C阴性对照溶液 1.对乙酰氨基酚；2.绿原酸；3.咖啡因；4.马来酸氯苯那敏；5.蒙花苷图1 HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 贮备液 分别精密称取绿原酸对照品10.55 mg，蒙花苷对照品10.65 mg置50 mL量瓶中，绿原酸量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度，蒙花苷量瓶中加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别量取上述溶液1.0 mL置15 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为绿原酸与蒙花苷对照品贮备液。

精密称取咖啡因对照品10.30 mg、马来酸氯苯那敏对照品10.46 mg置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，量取上述溶液各5.0 mL置15 mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为咖啡因与马来酸氯苯那敏对照品贮备液。

精密称取对乙酰氨基酚对照品51.72 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对乙酰氨基酚对照品贮备液。

2.2.2 混合对照溶液 量取“2.2.1”项下各对照品贮备液1.0 mL置同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为1.362 μg·mL-1绿原酸、4.496 μg·mL-1咖啡因、1.361 μg·mL-1蒙花苷、4.433 μg·mL-1马来酸氯苯那敏、206.7 μg·mL-1对乙酰氨基酚的对照品混合溶液。

2.2.3 供试品溶液 取相同批号的感冒灵胶囊10粒，精密称定，倾出内容物，测得其平均装量，研细，精密称取细粉约0.1 g(约相当于对乙酰氨基酚20 mg)置100 mL量瓶中，加50%的甲醇约50 mL超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷至室温后用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过即得。

2.2.4 阴性对照溶液 仿照感冒灵胶囊制剂制备处方，配制成不含对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、岗梅和野菊花的阴性样品，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察 精密量取绿原酸等5种成分对照品贮备液0.6、0.8、1.0、1.2、2.0、3.0 mL置10 mL量瓶中，照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。以样品浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到各线性回归方程(见表2)。

表2 5种化学成分的线性方程(n=6)

2.4 检出限和定量限 取“2.3”项下的低浓度对照品溶液，适当稀释后照“2.1” 项下色谱条件进样测定。色谱图见图2。260 nm波长：信噪比(S/N)约为10∶1时，测得对乙酰氨基酚、咖啡因与马来酸氯苯那敏的定量限分别为0.04、0.07与0.14 μg·mL-1，信噪比(S/N)约为3∶1时，测得其检出限分别为0.01、0.03与0.06 μg·mL-1。334 nm波长：信噪比(S/N)约为10:1时，测得绿原酸与蒙花苷的定量限分别为0.03与0.08 μg·mL-1，信噪比(S/N)约为3∶1时，测得其检出限分别为0.01与0.03 μg·mL-1。

A.对乙酰氨基酚；B.绿原酸；C.咖啡酸；D.马来酸氯苯那敏；E.蒙花苷图2 5种化学成分的定量限色谱图

2.5 精密度试验 精密量取“2.2.2” 项下对照品混合溶液，照“2.1” 项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算各色谱峰峰面积的RSD。对乙酰氨基酚、绿原酸、咖啡因、马来酸氯苯那敏和蒙花苷的RSD分别为0.1%、0.9%、0.4%、0.5%和0.4%(n=6)。

2.6 重复性试验 称取“2.2.3” 项下细粉约0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加50%的甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，并平行配置6份，照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各成分的含量。供试品中对乙酰氨基酚、绿原酸、咖啡因、马来酸氯苯那敏和蒙花苷含量的RSD分别为0.7%、1.1%、0.7%、0.7%、0.1%(n=6)。说明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密量取“2.2.2” 项下对照品混合溶液，分别在0、1、2、4、6、8、12 h时照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各成分的峰面积的RSD值，对乙酰氨基酚、绿原酸、咖啡因、马来酸氯苯那敏和蒙花苷峰面积的RSD分别为0.2%、0.5%、0.3%、0.5%、0.8%(n=7)。说明各成分对照品在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取“2.2.3”项下细粉约0.1 g置100 mL量瓶中，精密加入低、中、高浓度的各成分对照贮备液(80%、100%、120%)，每个浓度各配置3份，照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算各成分的回收率，见表3～7。

表3 对乙酰氨基酚回收率

表4 绿原酸回收率

表5 咖啡因回收率

表6 马来酸氯苯那敏回收率

表7 蒙花苷回收率

2.9 样品测定 取3批感冒灵胶囊，照“2.2.3”项下制得供试品溶液，分别精密量取混合对照溶液与供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算含量，测定结果见表8。

表8 样品测定结果

3 结果与讨论

3.1 测定波长的选择 对绿原酸、咖啡因、蒙花苷、马来酸氯苯那敏和对乙酰氨基酚进行紫外全波长扫描，绿原酸的最大吸收波长为324 nm，咖啡因的最大吸收波长为277 nm，蒙花苷的最大吸收波长为334 nm，马来酸氯苯那敏的最大吸收波长为260 nm，对乙酰氨基酚的最大吸收波长为257 nm。马来酸氯苯那敏在感冒灵胶囊中含量较低，故采用其最大吸收波长260 nm作为咖啡因、马来酸氯苯那敏及对乙酰氨基酚的测定波长。绿原酸和蒙花苷与其他3个成分最大吸收波长相差较大，因此采用334 nm作为测定波长。

3.2 溶剂的选择 由于蒙花苷在50%甲醇中的溶解度较差，首先选择甲醇作为溶剂，照“2.1”项下色谱条件将供试品及对照品溶液进样分析，结果各峰均呈现双峰，考虑到溶剂效应的影响，故将溶剂更换为50%的甲醇，进样分析发现峰形有着明显的改善，因此蒙花苷首先采用甲醇配置成一定浓度的贮备液，后续稀释均采用50%的甲醇作为溶剂，其余4种成分均采用50%的甲醇作为溶剂。

3.3 流动相的选择 首先采用甲醇-4%冰醋酸作为流动相，结果发现马来酸氯苯那敏峰拖尾较严重且与蒙花苷无法分离。因此，用三乙胺调节4%冰醋酸pH值至3.0，作为水相，有机相仍为甲醇进行分析，结果发现马来酸氯苯那敏峰形有了明显的改善，且与蒙花苷的分离度也符合要求，其余3个组分的峰形也较为理想，各组分间的分离度均符合要求。

3.4 耐用性考察 照”2.2.2”和”2.2.3”项下方法制备对照品溶液与供试品溶液,考察色谱条件(柱温、流速、色谱柱)发生变动的情况下,样品测定结果受影响的程度。柱温的变化：分别在柱温30、35和40 ℃条件下(其余色谱条件不变)进样分析，结果表明，柱温的变化仅对各色谱峰的保留时间略有影响，对测定结果无明显影响。流速的变化：分别在流速0.8、1.0和1.2 mL·min-1条件下(其余色谱条件不变)进样分析，结果表明，流速的变化仅对各色谱峰的保留时间及峰面积略有影响，对测定结果无明显影响。色谱柱的变化：分别考察资生堂Capcell PAK MGII C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，结果表明，采用资生堂Capcell PAK MGII C18及Agilent Zorbax Extend C18色谱柱时需要微调流动相的比例马来酸氯苯那敏与蒙花苷刚好能达到基线分离，而采用Waters XBridge C18色谱柱时两者间的分离效果远大于其余两根，故选择XBridge C18进行试验分析。

感冒灵胶囊中含有精神药品咖啡因，因此对咖啡因含量须严格控制。本方法中样品的预处理易于操作，直接溶解、过滤后即可测定并且按本品的处方配制的阴性空白对照溶液在该色谱条件下无吸收，不影响待测组分的测定。本方法采用HPLC法同时测定感冒灵胶囊中对乙酰氨基酚、绿源酸、咖啡因、蒙花苷及马来酸氯苯那敏的含量，方法快速简便、准确可靠、重现性好，为本品的含量测定及质量控制提供了可靠的依据。