纳米磁性颗粒介导的辣椒遗传转化体系建立

孙国胜 杨 宇 许可翠 张昌伟 戴忠良 孙春青 马志虎,*

(1 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400；2 南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

辣椒(CapsicumannuumL.)常规杂交育种已经取得了一定进展，但由于难以获得稳定的遗传转化体系，辣椒的转基因技术发展缓慢[1]。已有报道中，辣椒主要依靠农杆菌介导和基因枪法等构建遗传转化体系，例如，使用子叶[2]、下胚轴[3]、Flamingo-bill外植体[4]等作为外植体，试图建立农杆菌介导辣椒遗传转化体系，但是建立的遗传转化体系不稳定，或需要特定的材料才能获得再生体系。辣椒遗传转化中，采用易获得再生植株基因型的材料是成功的关键。目前尚缺乏有效的辣椒遗传转化体系，尤其是开发一套可操作性强、广谱性强、效率高的辣椒遗传转化体系对于CRISPR/Cas9技术的广泛应用尤为重要。

植物花粉纳米磁性颗粒转化法是一种磁性纳米载体介导的植物转基因方法，通过静电作用，将磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)ployMAG与载有目的基因的外源DNA结合，形成基因-纳米磁颗粒载体复合物，在强磁场的作用下，增加纳米磁性颗粒与花粉细胞的接触面积[5]，加速复合物通过花粉孔[6]传递至悬浮于辣椒花粉培养基的花粉中，经过人工授粉，通过花粉管通道[7]，得到转基因种子，稳定转化T0代植株并将目的基因整合到植物基因组中，实现外源目的基因的遗传转化，不需要再组织培养[8-9]。植物花粉纳米磁性颗粒转化法属于载体转化法中的非病毒载体转化方法[10-12]，克服了病毒载体无法运输大片段基因的局限性[13]，具有操作简单、无免疫活性[14]、目的基因不受体细胞内酶解影响[12,15]等特点。针对农杆菌遗传转化中效率低、耗时长、受物种及基因型限制[16]，尤其在辣椒中难以建立稳定的遗传转化体系等问题[17]，本研究无需经过组织培养，直接采用植物花粉纳米磁性颗粒转化法对辣椒进行基因的遗传转化，旨在为辣椒转基因技术的应用推广奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

受体为辣椒B2(来源于江苏丘陵地区镇江农业科学研究所)，种植于江苏丘陵地区镇江农业科学研究所行香创新中心温室大棚。载体为pCas9-TPC(质粒编号：CD3-1927)(图1)，购自美国Tair公司，为除草剂(草铵膦)抗性。磁性纳米载体为ployMAG(美国Chemicell公司)，磁板为MagnetoFACTOR plate24(美国Chemicell公司)。

图1 pCas9-TPC载体结构示意图

1.2 花粉磁转化与授粉

于2018年4月的晴天上午10:00左右收集辣椒花粉，选择花药成熟但还未散粉的花朵进行采粉，将24孔培养皿放置于花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，花粉铺满每个孔孔底，立即加入300 mL的液体花粉培养基，使花粉悬浮在培养基中。100 mL花粉培养基配方为：15%蔗糖+10 mg H3BO3+5.3 mg KNO3+10.3 mg Ca(NO3)2+51.7 mg MnSO4+10.3 mg MgSO4·7H2O+3.0 mg 赤霉素。

将磁性纳米颗粒ployMAG与载体质粒DNA (1 000 ng·μL-1)按质量比1∶1连接，即体系中含有1 μL (浓度为l μg·μL-1)磁性纳米颗粒和1 μL(浓度1 μg·μL-1)质粒DNA，室温连接30 min。将连接好的ployMAG/DNA复合物加入带有花粉的培养基中，置于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min，然后吸去上层液体，将转化的花粉吸至滤纸上，室温静置晾干。随后立刻授粉，并做好标记，将剩余转化花粉放置在4℃冰箱，下午15:00点以后重复授粉1次。

1.3 转化苗的抗性筛选

辣椒自然成熟后收获种子，随机取转化种子若干，播种后待长出第4片真叶时进行草铵膦抗性鉴定。草铵膦的使用浓度为0.2%，每10 d喷一次草铵膦，共计喷施3次，鉴定阳性植株。播种未转化辣椒为对照，用清水做同样处理。

1.4 转化苗PCR鉴定

随机选取草铵膦鉴定呈阳性的3株T0代植株提取DNA，随机选取5株草铵膦鉴定呈阳性的5株T0代植株提取RNA并反转录，未转化植株和清水为阴性对照，以pCas9-TCP质粒为阳性对照，进行PCR鉴定。

随机选取21株T2代植株提取DNA，另随机选取21株T2代植株提取RNA并反转录，对DNA和cDNA进行PCR鉴定，未转化植株和清水为阴性对照，以pCas9-TCP质粒为阳性对照，引物为Cas9-F:T G A G A A C A C T C A G C TC C A GA，Cas9-R:G A G A A C A G A G T AA G C C A C GG。

1.5 转化苗Southern杂交鉴定

选取pCas9-TCP质粒和随机选取8株PCR鉴定呈阳性植株叶片，提取基因组DNA，以未转化植株为对照，采用HindIII (日本TaKaRa公司)对基因组DNA进行酶切，回收片段转膜HyBond N+正电荷尼龙膜(美国Amersham公司)，用地高辛杂交检测试剂盒Ⅱ (化学发光法) (瑞士Roche公司)进行Southern杂交。

2 结果与分析

2.1 转化植株抗性鉴定

采用0.2%的草铵膦喷施转化植株和对照植株，转化植株共计146株，喷施3次后，存活93株转化阳性T0代(图2)植株，对照组全部死亡。纳米磁性颗粒介导的辣椒CRISPR/Cas9基因编辑转化效率约为63.70%。

2.2 转化植株PCR鉴定

对随机选取的5株草铵膦鉴定呈阳性的T0代植株进行PCR检测，检测CRISPR/Cas9载体是否存在于T0代植株中，以pCas9-TCP质粒为阳性对照，未转化植株和清水为阴性对照，鉴定结果如图3-a。草铵膦鉴定呈阳性的植株中均发现CRISPR/Cas9载体序列，与阳性对照片段大小一致，为预期的1 049 bp，胶回收后测序结果显示，序列为CRISPR/Cas9载体。

注：A: 野生型；B: 转化植株。

对随机选取的5株T0代草铵膦鉴定呈阳性植株进行cDNA检测，结果显示5个样品中均出现了目标条带(图3-b)，条带大小与以载体为模板扩增出来的一致，通过测序检测，序列同为CRISPR/Cas9载体。

注：a为DNA鉴定，b为cDNA鉴定；M: DL 2 000标记; 1和A: 阳性质粒；2和B: 水；3和C: 野生型DNA；4～8: 阳性植株DNA；D～H: 阳性植株cDNA。

对随机选取的21株T2代植株的DNA进行PCR鉴定结果显示，有16株扩增出与阳性对照一致的目的片段(图4)，随机选取2条进行胶回收，测序序列结果为CRISPR/Cas9载体，为阳性植株。

2.3 转化植株Southern杂交鉴定

对8株鉴定为阳性的植株进行Southern杂交鉴定结果显示，阳性对照和8个阳性植株中都随机出现了1～3条条带，阴性对照上未出现条带(图5)。说明CRISPR/Cas9载体以1～3个拷贝整合到了辣椒受体的基因组中。

3 讨论

目前农杆菌介导的辣椒遗传转化体系最大的困难就是再生植株获得困难[1]，农杆菌介导的遗传转化体系对于转化受体要求较高，不同基因型甚至同一基因型的不同植株的再生能力均存在差异[18-19]，这限制了辣椒遗传转化的发展。本研究采用磁性纳米颗粒介导的花粉通道法进行遗传转化，规避了辣椒植物再生的问题。

随着近些年纳米生物学的发展，纳米颗粒载体被认为是一种可有效解决植物遗传转化过程中转导介质穿透细胞壁的途径[20-22]。Kwak等[23]采用单壁碳纳米管载体将基因靶向传递至叶绿体。良好的纳米材料能够有效地与外源基因结合，并运输至靶细胞，前人研究中采用磁性纳米颗粒作为基因载体[24-26]，对外源基因进行标记、转运并在细胞中得到表达，说明磁性纳米颗粒介导的转化方法是一种非常有效的基因工程手段[27]。在棉花中通过四氧化三铁磁性纳米颗粒介导的遗传转化已经得到了成功应用[28-29]。

注：M: DL 2 000标记；1：水；2：野生型；3：阳性质粒；4～24：T2代植株。

本研究将磁性纳米颗粒与辣椒花粉相结合，在高强磁场的作用下，利用磁性纳米颗粒的强穿透性和高效的运载能力，将携带外源基因的磁性纳米颗粒穿透辣椒花粉孔，将外源基因整合到辣椒花粉中，再通过人工授粉收获辣椒种子。本研究采用磁性纳米颗粒与外源基因复合30 min，在磁场作用下整合30 min的方法，获得了辣椒T0代种子，经鉴定转化效率约63.70%，转化效率极高，远高于基因枪法介导的辣椒遗传转化法的4.2%[17]。

注：M: DNA分子量标记；C: 阳性质粒；1～8：阳性植株；9：野生型。

此外，运用磁性纳米颗粒对辣椒进行遗传转化，尤其应用在辣椒的基因编辑中，对于辣椒的遗传育种具有较好的参考作用。此方法的主要特点是转化效率高，操作简单，大田中即可操作，甚至在设施栽培中，一年可进行多次转化、鉴定，极大地缩短了转化、鉴定的周期；而且此方法还可以批量化、大规模转化，磁性纳米颗粒介导的辣椒基因编辑转化体系成本极低，转化一个基因的耗材成本约30元。

4 结论

本研究通过磁性纳米颗粒介导的辣椒遗传转化体系，有效解决了辣椒遗传转化时存在的基因型限制、诱导再生困难的问题，对辣椒遗传转化、基因编辑研究有重要意义，通过该体系可以有效进行辣椒基因功能研究，并通过基因工程，培育出更多的辣椒新品种。