益气养阴消瘿方对自身免疫性甲状腺炎模型大鼠B 细胞活化的调节作用

李 扬 牧亚峰 左新河, 田 曼▲ 赵 勇

1.湖北省中医院甲状腺疾病诊疗中心，湖北武汉 430070；2.湖北省中医药研究院甲状腺疾病诊疗中心，湖北武汉 430070；3.湖北中医药大学第一临床学院，湖北武汉 430061

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一种甲状腺的自身免疫性疾病，临床中以桥本甲状腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）最为常见，近年来HT的发病率高达3%～4%，并呈逐年增高趋势[1-2]。AIT 的典型病理改变为甲状腺淋巴细胞浸润，进一步出现纤维化、肿大或结节样改变，甚至引起甲状腺功能减退，并对妊娠结局有不良影响，研究其防治对优生优育有重要意义。本病目前尚无根治方法，西医主要以对症治疗为主，或联合硒剂或糖皮质激素等药物，而激素类药物易并发胃肠道反应、糖代谢异常及电解质紊乱等诸多不良反应，因此寻求安全有效的治疗策略十分必要。中医药在治疗AIT 方面有独特的优势，益气养阴消瘿方是已故全国名中医陈如泉教授根据多年临床经验所拟，具益气养阴、消瘿散结之功，临床疗效良好，且不良反应少，前期研究发现该方能改善AIT 模型大鼠甲状腺功能、减轻甲状腺肿大[3]。本研究拟进一步探讨其对AIT 的免疫调节机制，为该方临床应用提供更深层次理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～5 周SPF 级雌性SD 大鼠50 只，体重100～120 g，购自湖北省实验动物研究中心（动物许可证号SCXK 鄂2017—0012，合格证号：42010200002809），由湖北中医药大学伦理委员会审核批准动物实验。饲养于湖北中医药大学动物中心SPF 动物实验室，室温20～24℃，湿度40%～60%，适应性喂养1 周。

1.2 主要药物与试剂

猪甲状腺球蛋白（pTg）、碘化钠（NaI）、完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA），购自Sigma 公司（货号分别为T1126、746371、F5881、F5506）。B 细胞活化因子（BAFF）检测试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司，批号：SEB686Ra）。白细胞介素-10（IL-10）一抗（IL-10 Rabbit pAb，abclonal 公司，批号：A2171），Dako REAL EnVision Detection System（安捷伦Dako，K5007）。促甲状腺激素（TSH）、甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司；批号分别为E-EL-R0976、SBJ-R0551、CSBE11199r）。益气养阴消瘿方为陈如泉教授所拟，由黄芪30 g、白芍30 g、鬼箭羽20 g、穿山龙20 g 四味中药配制成1 g/mL 的溶液。

1.3 动物分组及造模方法

实验动物按随机数字表法分为正常对照组、模型组、益气养阴消瘿方低、中、高剂量组，每组10 只。除正常对照组外，其余组大鼠按本课题组前期成熟方法进行造模[4-6]。初次免疫：pTg 与CFA 等体积混合乳化，多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共2 次，同时给予高碘水（1 L 水中加入0.64g NaI）直到实验结束。再次免疫：pTg 与IFA 等体积混合乳化，再次进行多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共4 次。

1.4 给药方法

造模后开始药物干预，正常对照组与模型组每天予以生理盐水5 mL/kg 灌胃，益气养阴消瘿方低、中、高剂量组分别以益气养阴消瘿方溶液6、12、24 g/kg灌胃，连续6 周。

1.5 检测方法：

1.5.1 ELISA 法检测血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF含量 心脏采血，室温静置2 h，以转速2000 r/min 离心10 min，离心半径6 cm，取血清至EP 管中，-20℃储存。血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF 检测均按试剂盒说明书详细步骤规范操作，读数。

1.5.2 免疫组化法检测甲状腺组织IL-10 的相对表达水平 实验结束后，各组大鼠禁食禁水12 h，称重，10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离甲状腺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色观察甲状腺组织病理改变，免疫组化法检测甲状腺组织IL-10 表达。主要步骤为：脱蜡，3%过氧化氢液封闭，血清封闭，再分别加入IL-10 的一抗（1∶100），孵育，PBS 冲洗，再按Dako REAL EnVision Detection System试剂盒标准步骤操作，最后经DAB 溶液显色。阴性对照以PBS 代替一抗。以棕黄色颗粒为阳性。每张玻片随机选择20 个视野（400×），用HMIAS-2000 千屏高清彩色医学图文分析系统进行吸光度测量并自动转换为吸光度（A）值，每个标本的IL-10 相对表达含量用20 个视野的平均A 值表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比较

与正常对照组比较，模型组血清TSH、TGAb、TPOAb 浓度均升高，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。益气养阴消瘿方中、高剂量组TSH、TPOAb、TGAb 浓度均低于模型组，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01），益气养阴消瘿方低剂量组TPOAb、TGAb 浓度低于模型组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。益气养阴消瘿方中、高剂量组TSH 浓度均低于益气养阴消瘿方低剂量组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；而益气养阴消瘿方中、高剂量组TSH 浓度比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。益气养阴消瘿方低、中、高剂量组TPOAb 浓度两两比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。益气养阴消瘿方高剂量组TGAb 浓度低于益气养阴消瘿方中、低剂量组，且益气养阴消瘿方中剂量组低于益气养阴消瘿方低剂量组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比较（）

表1 各组大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比较（）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与益气养阴消瘿方低剂量组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与益气养阴消瘿方中剂量组比较，▲P ＜0.05。TSH：促甲状腺激素；TPOAb：甲状腺过氧化物酶抗体；TGAb：甲状腺球蛋白抗体

2.2 各组大鼠甲状腺组织病理观察结果

与正常对照组比较，模型组甲状腺组织可见大量淋巴细胞浸润，甲状腺滤泡结构紊乱。与模型组比较，益气养阴消瘿方各剂量组甲状腺淋巴细胞浸润减少，甲状腺滤泡结构紊乱减轻。见图1。

2.3 各组大鼠血清BAFF 含量比较

与正常对照组比较，模型组血清BAFF 含量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，益气养阴消瘿方各剂量组BAFF 含量均降低，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。益气养阴消瘿方高剂量组BAFF 含量低于益气养阴消瘿方低剂、中剂量组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），益气养阴消瘿方低、中剂量组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2。

2.4 各组大鼠甲状腺组织IL-10 的表达水平比较

在大鼠甲状腺组织中，IL-10 主要表达于滤泡上皮细胞。与正常对照组比较，模型组甲状腺组织IL-10相对表达水平显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，益气养阴消瘿方各剂量组甲状腺组织IL-10 相对表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。益气养阴消瘿方中、高剂量组IL-10表达水平均高于益气养阴消瘿方低剂量组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。益气养阴消瘿方中、高剂量组IL-10 相对表达水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3～4。

图1 各组大鼠甲状腺组织病理学观察（HE 染色，100×）

图2 各组大鼠血清BAFF 水平比较（n=10）

图3 各组大鼠甲状腺组织IL-10 免疫组化（400×）

3 讨论

HT 是AIT 中最为常见的类型，TGAb、TPOAb 是参与HT 病理损伤的核心抗体，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用是HT 的主要病理机制[7]。目前西药治疗HT 方法十分有限，临床用药局限于硒制剂糖皮质激素。本研究采用以皮下注射pTg 并配合高碘水喂养的经典方法模拟HT 模型，观察了益气养阴消瘿方对AIT 模型大鼠TGAb、TPOAb 的影响，结果发现益气养阴消瘿方可显著降低血清TGAb、TPOAb 含量，下调TSH 水平，体现出对甲状腺功能的保护作用，从而显示了中药调节甲状腺免疫失衡的优势。

图4 各组大鼠甲状腺组织IL-10 免疫组化吸光度半定量分析（n=10）

多数研究证实T 细胞免疫失调是AIT 的核心机制[8-10]，而B 细胞的激活及其对T 细胞应答的效应是AIT 不可或缺的重要环节[11-12]。TGAb、TPOAb 均由B淋巴细胞产生，B 细胞激活CD8+T 细胞和巨噬细胞[13]，损伤甲状腺滤泡上皮细胞[14]。BAFF 是B 细胞活化的重要细胞因子，调控B 细胞的活化、增殖及分化[15]，HT患者血清BAFF 水平升高[15-16]。目前针对B 细胞免疫环节治疗AIT 的中医药研究相对较少，故本研究探讨了益气养阴消瘿方对AIT 模型大鼠BAFF 的调节作用，结果显示，模型组血清BAFF 水平较正常对照组明显升高，提示AIT 模型大鼠B 细胞免疫被激活，而益气养阴消瘿方可显著降低血清BAFF 水平，从而抑制B 细胞活化，提示该方可通过下调BAFF 水平发挥重要的B 细胞免疫调节作用。

IL-10 是一种免疫抑制因子，可以抑制T 淋巴细胞活化[17]，减少甲状腺组织淋巴细胞浸润，并一定程度上阻止甲状腺滤泡细胞的破坏[18]。1 项对91 例HT患者的临床数据分析显示其血清IL-10 水平显著减低，提示HT 患者该细胞因子功能下降[19]。本研究显示AIT 模型大鼠甲状腺组织IL-10 水平显著降低，该结果与既往文献报道一致[20-21]。Rosser 等[22]研究发现分泌IL-10 的B 细胞具有免疫抑制作用，称其为调节性B 细胞（Breg 细胞），Breg 细胞能改变T 细胞分化[23]，可通过IL-10 抑制Th1 免疫反应，并间接抑制Th1、Th17 细胞分化[24]，而后者功能紊乱是HT 的重要机制[25]。本研究探索了益气养阴消瘿方对AIT 模型大鼠甲状腺组织IL-10 表达水平的影响，发现其可显著增加甲状腺组织IL-10 的表达，故而推测该方可能通过促进分泌IL-10 的Breg 细胞的生成而发挥免疫调节作用，但尚需进一步实验验证。

AIT 可归属于中医“瘿病”范畴，多因情志内伤、肝气郁结，而致脾运失健，脾气虚弱，津液无以敷布，凝聚为痰，阴津亏虚，血行不畅，瘀血内滞，痰瘀互结，壅结颈部而成。临床上HT 患者多属气阴两虚证，陈如泉教授以“益气养阴法”为治则，拟益气养阴消瘿方，由黄芪、白芍、鬼箭羽、穿山龙四味药组成，方中黄芪为君药，健脾益气；白芍为臣，柔肝理气；佐以鬼箭羽、穿山龙活血通经、消瘿散结，全方共奏“益气养阴、消瘿散结”之功效。现代药理学及实验研究发现黄芪多糖可提高免疫抑制小鼠Treg 细胞数的比例[26-28]；白芍总苷有利于恢复Th17/Treg 平衡[29]；穿山龙可调节HT 患者外周Th17、Treg 细胞相关细胞因子[30]。这些研究均佐证了益气养阴消瘿方的免疫调节功能。本研究结果显示益气养阴消瘿方可降低AIT 大鼠TSH、TGAb、TPOAb 水平，改善免疫失衡状态，可能与其抑制B 细胞活化的机制相关，为其临床应用提供了更深层的理论依据。