响应面优化超声辅助提取黄瓜皮多酚工艺及其抗氧化活性研究

陈建福 ，陈健旋 ，袁思琦 ，陈仲巍

（1.漳州职业技术学院食品工程学院，福建 漳州 363000；2.天然化妆品福建省高校工程研究中心,厦门医学院，福建 厦门 361023）

黄瓜（Cucumis sativus L.），又名青瓜、胡瓜，为葫芦科黄瓜属一年生蔓生或攀缘草本植物，黄瓜营养丰富，种植历史悠久，在我国各个地方均有分布[1-2]。黄瓜主要由黄瓜籽、黄瓜肉和黄瓜皮三部分组成，其中黄瓜皮是最容易被人们忽视的部分，其含有多糖、多酚、绿原酸、氨基酸等多种天然有效营养活性成分，具有生津止渴、排毒、清肠、降尿酸、护肾、养颜等多种功效[3-4]。其中多酚是植物的次生代谢产物，广泛存在于植物果、皮、叶、茎和根中，具有抗血栓、抗炎、抑菌、抗氧化、抗凝血和抗衰老等多种生物生理活性，广泛应用于化妆品、饲料、食品等各个领域中[5-6]。本文以黄瓜皮为原料，对影响黄瓜皮多酚提取率的工艺因素进行Box-Behnken 设计与响应面优化，并研究了黄瓜皮多酚的抗氧化活性，为黄瓜皮多酚的提取与综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄瓜，亮美1 号，购于漳州市新华都超市，使用时将黄瓜用清水洗净，再将黄瓜皮削下，风干，后放于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后筛选备用。乙醇，食品级，河南鑫河阳酒精有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

KQ-100TDE 型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-1100 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的测定

采用福林-酚法[7]，配制100 mg/L 没食子酸标准溶液，分别移取一定体积的没食子酸标准溶液到容量为10 mL 的容量瓶中，再分别加入0.5 mL 福林-酚试剂，摇匀后静置1 min，然后加入1.5 mL 质量分数为20%的Na2CO3溶液，定容。于75 ℃反应10 min 后置于765 nm 分光光度计下测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度（mg/L）为横坐标，得标准曲线为 y=0.084x+0.006，R2=0.999 0。

1.2.2 黄瓜皮多酚含量的测定

取一定量的黄瓜皮提取液，根据上述标准曲线测定方法，将分光光度计波长设为765 nm，测定溶液的吸光值。根据标准曲线能够计算出多酚的浓度，因而得到多酚物质的提取率：

式中：V 为提取液体积（L）；m 为黄瓜皮质量（g）；b 为黄瓜皮多酚质量浓度（mg/L）。

1.2.3 黄瓜皮多酚的提取工艺

准确称取3 份1 g 的黄瓜皮制成的粉末，分别把粉末装入100 mL 烧瓶中，按所考察的工艺条件加入设定的乙醇，后置于高频数控超声波清洗器中进行提取，结束后过滤、定容，按“1.2.2”方法计算黄瓜皮多酚的提取率，结果取平均值。

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 超声温度的筛选

准确称取1 g 的黄瓜皮粉末，加入25 mL 60%的乙醇，分别在 55、60、65、70、75 和 80 ℃的超声波清洗器中超声提取30 min，过滤、定容，研究不同超声温度对黄瓜皮多酚提取率的影响，筛选适宜的超声温度。

1.2.4.2 乙醇浓度的筛选

准确称取1 g 的黄瓜皮粉末，加入浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%和 90%（体积分数）的25 mL 乙醇溶液，在65 ℃的超声波清洗器中超声提取30 min，过滤，定容，研究不同乙醇浓度对黄瓜皮多酚提取率的影响，筛选适宜的乙醇浓度。

1.2.4.3 液料比的筛选

准确称取1 g 的黄瓜皮粉末，分别加入10、15、20、25、30 和 35 mL 的 60%乙醇，在 65 ℃的超声波清洗器中超声提取30 min，过滤，定容，研究不同液料比对黄瓜皮多酚提取率的影响，筛选适宜的液料比。

1.2.4.4 超声时间的筛选

准确称取1 g 的黄瓜皮粉末，加入25 mL 的60%乙醇，在65 ℃超声波清洗器内分别超声10、20、30、40、50、60 min，过滤，定容，研究不同超声时间对黄瓜皮多酚提取率的影响，筛选适宜的超声时间。

1.2.5 响应面试验设计

在黄瓜皮多酚提取单因素试验的基础上，将多酚提取率作为响应值，选取超声温度、乙醇浓度、液料比、超声时间作为试验的4 个因素，如表1 所示，并结合Box-Behnken 设计原理，设计出四因素三水平试验，对提取黄瓜皮多酚的工艺进行响应面优化。

表1 Box-Behnken 响应面因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response methodology

1.2.6 黄瓜皮多酚的抗氧化活性测定

1.2.6.1 ·OH 清除率的测定

取2 mL 不同质量浓度的黄瓜皮多酚溶液，并分别加入2 mL 浓度为9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液和1 mL 浓度为9 mmol/L 的FeSO4溶液，混合均匀后再加入0.01% H2O2溶液1 mL 反应60 min，反应结束后，用蒸馏水定容，测定溶液在510 nm 处吸光度Ai；并分别以蒸馏水代替H2O2溶液为对照组，测得吸光度Aj，以蒸馏水代替黄瓜皮多酚为空白组，测得吸光度A0，按下式计算出黄瓜皮多酚对·OH 的清除率。

·OH 清除率（%）=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.2.6.2 DPPH·清除率的测定

取2 mL 不同质量浓度的黄瓜皮多酚溶液，并分别加入2 mL 浓度为0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，混合均匀后，反应30 min，反应结束后测试其在517 nm 处的吸光度Ai；取2 mL 不同质量浓度的黄瓜皮多酚溶液，加入2 mL 乙醇，测定其在517 nm 处的吸光度Aj；取2 mL 蒸馏水加入2 mL 浓度为0.2 mmol/L 的DPPH溶液，测得吸光度A0；并以VC 作对照，按下式计算得黄瓜皮多酚对DPPH·的清除率。

DPPH·清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.7 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 进行存储与数据分析，用Origin 8.0 进行绘图，用Design-Expert 8.05b 软件进行响应面回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声温度对多酚提取率的影响

如图1 所示，当超声温度为65 ℃时，黄瓜皮多酚提取率达到最大值，超声温度超过65 ℃后，多酚提取率没有继续增加，而是开始降低。这是因为超声温度的升高，会促进多酚分子的热运动而加快多酚物质溶出的速度；但超声温度过高时，部分多酚的物质结构会被破坏，从而降低提取率[8]。由此，适宜的超声温度为 65 ℃。

图1 超声温度对多酚提取率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic temperatures on the extraction yields of polyphenols

2.1.2 乙醇浓度对多酚提取率的影响

图2 乙醇浓度多酚对提取率的影响Fig.2 Effects of ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

如图2 所示，当乙醇浓度为60%时，黄瓜皮多酚提取率达到最大值，乙醇浓度超过60%后，多酚提取率没有继续增加，而是开始降低。这是因为乙醇浓度的增大，会加快多酚和多糖、蛋白质等物质之间的疏水作用力及氢键的断裂，使多酚提取率上升；但乙醇浓度过大时，黄瓜皮颗粒中醇溶性物质会加快溶出，从而阻碍多酚物质的溶出[9]。由此，适宜的乙醇浓度为60%。

2.1.3 液料比对多酚提取率的影响

如图 3 所示，当液料比为 25∶1（mL/g）时，黄瓜皮多酚提取率达到最大值，液料比超过25∶1（mL/g）后，多酚提取率没有继续增加，而是开始降低。这是因为随着液料比的增加，溶剂和原料之间的接触面积也会增加，使多酚更多地溶解出来；但液料比过大时，溶剂和原料已经充分结合，多余的溶剂会使过多杂质溶出，而导致提取率下降，同时，考虑到降低能耗、减少溶剂用量、降低原料等各方面的因素[10]，选择适宜的液料比为 25∶1（mL/g）。

图3 液料比对多酚提取率的影响Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

2.1.4 超声时间对多酚提取率的影响

如图4 所示，当超声时间为30 min 时，黄瓜皮多酚提取率达到最大值，超声时间超过30 min 后，多酚提取率没有继续增加，而是开始降低，这是因为在一定超声时间范围内，多酚逐渐溶出，多酚提取率增大，但超声时间过长时，超声波的热效应导致多酚中相关不稳定组分的降解，使得提取率降低[11]，由此，适宜的超声时间为30 min。

图4 超声时间对多酚提取率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.2 响应面工艺优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

以黄瓜皮多酚提取率为响应值，应用Box-Behnken试验设计原理，选择超声温度（A）、乙醇浓度（B）、液料比（C）和超声时间（D）为影响因素，得出试验结果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.05b 软件对表2 的试验数据进行响应面回归分析，可得多酚提取率为响应值的二次多项回归模型为：

Y=10.28+0.052A+0.19B+0.17C+0.21D-0.015AB+0.053AC-0.097AD-0.12BC-0.12BD-0.10CD-0.35A2-0.37B2-0.36C2-1.04D2

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

对回归模型进行方差分析，以此检验各因素对多酚提取率的影响，结果见表3。由表3 可得，回归模型的F=25.04，P＜0.000 1，表明模型极显著。失拟项P=0.934 2＞0.05，表示差异不显著，具有较好的拟合性，由随机的误差引起小偏差；该方程模型的决定系数R2=0.961 6，证明有96%以上的试验值可以利用该模型来分析与预测。综上分析可知该回归模型的拟合度高，响应面值和各因素之间关系都能够被较好地描述出来，因此可用该回归模型来代替试验对黄瓜皮多酚的提取率进行预测与分析。各因素对响应值的影响不同，不是简单的线性关系，其中一次项B、C、D 及二次项 A2、B2、C2和 D2对响应值影响极显著（P＜0.01），其余项均影响不显著。

2.2.2 响应曲面图分析

为进一步分析超声温度、乙醇浓度、液料比和超声时间对黄瓜皮多酚提取率的影响，通过Design-Expert 8.05 b 软件绘制出响应面和等高线图，如图5～10 所示。图中显示固定所考察因素中的任意两个因素时，另两个因素交互作用的影响。从响应面中的曲面坡度和等高线中线的疏密程度可以反映出所考察工艺之间交互作用的强弱，即响应面曲面的坡度越陡，倾斜度越高，等高线形状越趋向椭圆，等高线密度越大，表示该交互作用越显著[12]。对图5～10 进行分析可知，响应面曲面倾斜度最大，等高线密度最大的是乙醇浓度和超声时间的交互作用图，说明乙醇浓度和超声时间的交互作用对响应值的影响最显著；同理分析，可以得到四个因素之间交互作用对响应值的影响显著程度顺序为：BD＞BC＞CD＞AD＞AC＞AB。

2.3 最佳工艺条件的确定与验证

利用软件对所建立的模型进行分析，得到黄瓜皮多酚的最佳提取工艺为：超声温度65.36 ℃，乙醇浓度 62.10%，液料比 25.96∶1（mL/g），超声时间 30.76 min，此条件下多酚提取率预测值为10.33 mg/g。考虑操作的方便性，选取超声温度65 ℃，乙醇浓度62%，液料比 26∶1（mL/g）、超声时间 31 min 进行验证试验。在此修改后的最佳工艺条件下进行3 次平行试验，所测多酚提取率的平均值为（10.29±0.14）mg/g，与预测值相对误差为0.39%，证明了回归模型的有效性，由此可以说明应用响应面法所得到的提取工艺的参数可行性强、可靠性高。

图5 超声温度与乙醇浓度的交互作用对多酚提取率的影响Fig.5 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

图6 超声温度与液料比的交互作用对多酚提取率的影响Fig.6 Interaction effects of ultrasonic temperatures and liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

图7 超声温度与超声时间的交互作用对多酚提取率的影响Fig.7 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

图9 乙醇浓度与超声时间的交互作用对多酚提取率的影响Fig.9 Interaction effects of ethanol concentrations and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

图10 液料比与超声时间的交互作用对多酚提取率的影响Fig.10 Interaction effects of liquid-to-material ratios and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.4 黄瓜皮多酚的抗氧化活性

2.4.1 黄瓜皮多酚对·OH 的清除作用

如图11 所示，利用黄瓜皮多酚对·OH 清除作用来评价其抗氧化能力。从图中可知，随着黄瓜皮多酚和VC 质量浓度的升高，其对·OH 的清除率均不断增大，当黄瓜皮多酚质量浓度为350 mg/L 时，对·OH 清除率达到85.74%，说明黄瓜皮多酚具有较强的·OH清除能力，黄瓜皮多酚和VC 对·OH 清除率的IC50分别为116.60 mg/L 和97.59 mg/L，说明黄瓜皮多酚具有较好的抗氧化活性。

图11 黄瓜皮多酚和VC 对·OH 的清除作用Fig.11 Scavenging effects on·OH of polyphenols and VC

2.4.2 黄瓜皮多酚对DPPH·的清除作用

图12 黄瓜皮多酚和VC 对DPPH·的清除作用Fig.12 Scavenging effects on DPPH·of polyphenols and VC

如图12 所示，利用黄瓜皮多酚对DPPH·清除作用来评价其抗氧化能力。从图中可知，随着黄瓜皮多酚和VC 质量浓度的升高，对DPPH·的清除率均不断增大，当黄瓜皮多酚质量浓度为140 mg/L 时，对DPPH·清除率达到82.15%，说明黄瓜皮多酚具有较强的DPPH·清除能力，黄瓜皮多酚和VC 对DPPH·清除率的IC50分别为57.41 mg/L 和47.68 mg/L，说明黄瓜皮多酚具有较好的抗氧化活性,且抗氧化活性与多酚浓度呈正相关。

3 结论

本研究采用超声波辅助法提取黄瓜皮多酚，在单因素试验的基础上，通过响应面法分析，建立了多酚提取率和考察工艺之间的回归模型，优化得出提取多酚的最佳工艺条件为：超声温度65 ℃，乙醇浓度62%，液料比 26∶1（mL/g），超声时间 31 min，在此条件下得到的多酚提取率为（10.29±0.14）mg/g，与预测值（10.33 mg/g）相对误差为0.39%，证明了回归模型的有效性，说明应用响应面法所得到的提取工艺参数可行性强、可靠性高。黄瓜皮多酚对·OH 和DPPH·清除率的IC50值分别为116.60 mg/L 和57.41mg/L，表明黄瓜皮多酚具有较好的抗氧化活性，且抗氧化活性与多酚浓度呈正相关，该研究为将黄瓜皮多酚开发成天然抗氧剂提供理论基础。