燕山地区板栗果实香气成分的GC-MS 分析

李 杰，王 雨，刘诗源，高 倩，韩继成

（河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北 昌黎 066600）

板栗（Castanea mollissima Blume.）为山毛榉科栗属植物，原产于我国，是我国特有的优良经济林树种之一[1]。板栗植株耐瘠薄，抗寒性和抗旱性较强，适合在我国北方燕山板栗栽培区的山地、丘陵栽培，是山区农民脱贫致富的主要产业和提高农民收入的主要经济来源。板栗果实不仅营养丰富，还可养胃健脾、补肾强筋[2]。燕山地区板栗果实呈椭圆形，果皮褐色，果面明亮，果肉淡黄色，肉质细糯，风味香甜，涩皮易剥离，适于炒食，是糖炒板栗的主要品种来源。

香气成分是构成和影响板栗果实鲜食及加工产品的重要因素之一[3-5]，是当前研究的热点之一。但与苹果[6-8]、梨[9-11]、葡萄[12-13]、桃[14-15]等果实的香气研究相比，国内外关于板栗香气的研究报道还是较少。梁建兰等[3]采用溶液萃取法对“燕龙”板栗的香气成分进行了研究；Krist 等[5]使用非极性柱RTx-5 结合溶液萃取法检测到烤意大利板栗中香气物质，因其萃取时使用有机溶剂且分析样品量大、操作过程复杂，在测定过程中很有可能造成部分香气组分的损失；Künsch等[16]、Morini 等[17]、叶兴乾等[18]相继测定不同品种及不同加工方式中板栗的香气成分，但并未对萃取头及色谱柱的选用进行筛选，局限了香气种类的测定。固相微萃取方法（Solid Phace Microextraction, SPME）具有不需有机溶剂，分析样品量少，操作简单、快速、费用低，集采样、萃取、浓缩及进样于一体等优点，能有效避免香气组分的损失[19]。为更好地了解燕山地区特有板栗品种的香气成分及组成，本试验采用固相微萃取-气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）联用技术，通过比较在使用强极性色谱柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）条件下7 种不同萃取头萃取香气成分的差异，筛选出一种适合萃取板栗香气的最佳效果的萃取头，对“大板红”、“冀栗 1 号”及“燕山早丰”3 个板栗品种的果实香气成分进行测定分析和比较，以期为板栗果实品质鉴定及其香气物质的遗传分析提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

以河北省农林科学院昌黎果树研究所孔庄基地13 年生的“大板红”、“冀栗 1 号”及“燕山早丰”为试材，基地土壤肥沃，采用常规管理，树体生长良好。

D-葡萄糖酸内酯、交联聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVPP）、4-甲基-2-戊醇(4M2P)、C7-C20正构烷烃。

1.1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 型气相色谱质谱联用仪，日本SHIMADZU 公司；HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）极性色谱柱，美国Agilent 技术有限公司；ME303E/02 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Heraeus Megafuge 8R 型高速离心机，热电实验设备有限公司奥斯特罗德分公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及处理

果实于成熟期采收。于树冠外围中部随机摘取20 个果实，每个品种3 株。之后每品种随机选取30个果实，果实去皮后称取约50 g 用液氮冷冻，加入0.5 g D-葡萄糖酸内酯和1 g PVPP，迅速破碎成粉末状，置于-80 ℃冰箱中保存，用于香气物质的测定。

样品取出后，迅速解冻，4 ℃条件下于8 000 r/min离心10 min，吸取上清液4 mL 置于样品瓶中，加入10 μL 内标4-甲基-2-戊醇水溶液（1.038 8 g/L）后，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧，静置20 min，使挥发性成分在液体中、顶空和萃取头三相中分布达到平衡，然后将老化过的萃取头插入样品瓶的顶空部分，在磁力加热搅拌器上于40 ℃萃取30 min，取下萃取头，立即在GC 进样口250 ℃条件下解析5 min。每个样品重复萃取进样3 次。

1.2.2 萃取头筛选

选择7 种萃取头对板栗果实香气成分进行萃取，比较萃取到的香气种类，以期选择1 个最佳萃取效果的萃取头。各萃取头在使用前根据使用说明对萃取头在一定的温度下进行一定时间的老化。各萃取头特点见表1。

1.2.3 气相色谱-质谱条件分析

气相色谱-质谱联用仪型号为GCMS-QP2010。气相色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气He 气（纯度 99.999%）；柱流量 1 mL/min；进样口温度250 ℃；色谱柱升温程序为：初始温度50 ℃，保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升至 120 ℃，保持3 min，再以 13 ℃/min 升至 250 ℃，保持 3 min；进样：不分流进样。质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV，质量扫描范围：30～500 amu，离子源温度 230 ℃，接口温度250 ℃。

1.2.4 香气成分定性定量分析

定性方法：依据保留指数法进行定性分析。正构烷烃在同样的气相色谱-质谱条件下进样，获得正构烷烃内各组分的保留时间，利用自动质谱图解卷积和鉴定系统（Automatic Mass Spectral Deconvolution andIdentification System，AMDIS）建立保留指数校正库，利用保留指数及NIST11 谱库，比对在同样极性色谱柱条件下测得的香气成分保留指数结果进行定性，将定性结果依靠可信度强弱分类并详细记录，确定各化学成分。

表1 不同萃取头涂层的使用调节指南Table 1 Conditioning guidelines of different SPME fiber coatings

定量方法：采用峰面积归一法进行各香气组分的定量分析。

2 结果与分析

2.1 萃取头的选择

由于各种萃取头的涂层材料及涂层厚度不同，导致萃取头的极性不同，所以各萃取头对不同挥发性物质的吸附能力也是不同的。根据“相似相溶”的原则，PDMS 为非极性萃取头，其主要吸附为非极性物质；PDMS/DVB 萃取头为极性萃取头，主要吸收极性挥发性醇类、胺类物质；PA 萃取头和DVB/CAR/PDMS 萃取头为极性萃取头，其中PA 的极性要弱于DVB/CAR/PDMS。运用GC-MS-计算机联用检测技术，得到7 种不同萃取头萃取到的板栗果实香气成分总离子图（图1）。由图1 可见，7 种萃取头均能检测到板栗果实的部分香气成分，并且50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头检测到的香气成分中包括了其他6 种萃取头所能检测出的挥发性物质。总之，通过比较7 种不同萃取头对板栗果实香气成分萃取效果发现，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 的萃取效果明显好于其他6 种萃取头。因此，后续板栗果实香气成分研究工作中将采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头。

图1 7 种萃取头得到的板栗果实香气成分的GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components with 7 different fiber coatings

2.2 板栗果实香气成分的测定分析

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头提取板栗品种“大板红”、“冀栗1 号”及“燕山早丰”果实香气成分，各组分质谱经与计算机谱库NIST11 和Wiley检索及保留指数分析，确认其香气成分，运用峰面积归一化法，求得各香气成分的相对含量（表2）。由表2可见，从3 个板栗品种的果实中共检测到62 种香气成分，“大板红”、“冀栗 1 号”及“燕山早丰”分别检测到33、38 和34 种；各品种的主要香气成分差异较大，且相对百分含量排在各品种板栗前10 位的芳香成分依次分别为己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇、1-丁醇、2,3-丁二酮、乙酸丁酯、2-己烯醛、2-己醇；乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、反-2-辛烯醛、2-丁烯醛、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、2-戊酮；己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、1-庚醇、2,3-丁二酮、2-丁烯醛、2-戊酮、乙醛。3-戊烯-2-酮、庚醛和1-己醇在3 个品种中均具有较高的相对含量，含量在8%～13%，为板栗的主要香气成分。

表2 燕山地区板栗品种香气成分的GC-MS 分析Table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

续表2 燕山地区板栗品种香气成分的GC-MS 分析Continue table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

2.2.1 醛类成分的差异

由表2 可见，醛类化合物是测定板栗果实香气成分中相对含量最高的一类化合物，共检测到11 种醛类化合物，“大板红”、“冀栗 1 号”及“燕山早丰”3 个品种板栗分别为4 种、5 种、11 种，其相对含量分别为40.96%、38.78%和50.38%；检测到共有醛类化合物有2 种，一种为庚醛，以“燕山早丰”的相对含量最高，达9.07%，分别是“大板红”、“冀栗1 号”含量的1.13、1.10 倍；另一种为反-2-辛烯醛，以“冀栗1 号”的相对含量最高，达4.25%，分别是“大板红”、“燕山早丰”含量的7.59、3.24 倍。板栗品种间成分差异较大，如“大板红”和“燕山早丰”以C6 醛类中的己醛为主，相对含量最高，分别为30.24%、35.41%；而“冀栗1 号”中以乙醛为主，含量高达22.20%；同时，还分别从3 个品种中检测到含量较低的反-2-辛烯醛、丁醛、2-丁烯醛等成分。

2.2.2 醇类成分的分析

由表2 可见，“大板红”、“冀栗1 号”及“燕山早丰”3 个品种板栗香气成分中检测到19 种醇类，分别为13 种、13 种和12 种；而总醇的相对含量在20%左右，3 个品种分别为18.24%、23.67%、18.95%。醇类成分多为1-丁醇和C6 醇类（1-己醇），以“冀栗 1 号”果实中1-丁醇的相对含量最高，达4.96%，“大板红”次之，“燕山早丰”最低（3.12%）；“燕山早丰”果实中 C6醇类（1-己醇）含量最高，为8.01%，“燕山早丰”次之，“大板红”最低，仅为7.09%。

此外，从果实中检测了到少量的3-甲基-1-丁醇、反-2-己烯-1-醇，1-戊醇、1-辛烯-3-醇等成分。

2.2.3 酮类成分的分析

由表 2 可见，“大板红”、“冀栗 1 号”及“燕山早丰”3 个品种板栗香气成分中检测到11 种酮类，分别为4 种、8 种和5 种；而总酮的相对含量在20%左右，3 个品种分别为 15.91%、19.10%、17.11%。3 个品种板栗果实香气成分中均以3-戊烯-2-酮相对含量最高，分别为11.76%、11.81%、12.56%。同时，还分别从3 个品种中检测到含量较低的四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基3-戊酮等成分。

2.2.4 酯类和其他成分分析

3 个品种板栗果实中共检测到2 种酯类成分，为乙酸丁酯和乙酸己酯。其中只有在“大板红”中检测到这两种物质，相对含量分别为2.25%、11.58%，而其他两个板栗品种中均未检测到酯类物质。

其他香气成分相对含量在1%以下，包括10 种烷烃、4 种呋喃、2 种胺、2 种酸和 1 种醚类。

2.3 香气成分的类别比较

由表3 可以看出，在检测到的9 类化合物中，参试的3 个板栗品种相对含量差异明显。同一品种板栗不同种类化合物之间相对含量不同，“大板红”以醛类、醇类、酮类和酯类为主，而“冀栗1 号”和“燕山早丰”以醛类、醇类和酮类为主；在同类化合物中，不同品种板栗的相对含量存在明显差异，其中醛类以“燕山早丰”相对含量最高（50.38%），分别是“大板红”与“冀栗 1 号”的 1.23、1.30 倍；醇类以“冀栗 1 号”最高（23.67%），分别是“大板红”与“燕山早丰”的1.30、1.25 倍；而酮类以“冀栗1 号”相对含量最高（19.10%），分别是“大板红”与“燕山早丰”的1.20、1.12 倍。

表3 不同板栗品种果实香气成分类别及相对含量Table 3 Aroma categories and relative contents of different Chinese chestnuts cultivars

3 讨论与结论

基于“相似相溶”的原理，不同材料的萃取头对挥发性物质吸附具有选择性。在参照以往研究的基础上，采用更准确可靠的SPME-GC-MS 联用技术对不同品种板栗果实的香气成分进行研究，结果表明：使用色谱柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分析时，萃取头 DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取到的香气种类最多，因此，在后续试验测定不同板栗品种的香气成分时可选用，该方法可以快速准确地提取到板栗的多种香气成分。

目前，国内外对板栗特征香气成分尚无统一认识，丁内酯和2-羟基-γ-丁内酯这两种内酯类物质具有愉快的水果香和坚果香，一般被认为是烤板栗的特征性香气物质[5,20]。本研究发现，3 个生板栗品种（未加工处理）中均含有大量庚醛、1-己醇和3-戊烯-2-酮等果香味的成分；“大板红”和“燕山早丰”中含有大量果香味的己醛；而具有甜香味的乙酸丁酯和乙酸己酯仅在“大板红”中被检出，并且相对含量很高。该分析结果为后续研究不同品种间板栗果实特征香气组分分析和品质评价奠定了基础。

本研究支持板栗品种间香气成分种类和含量存在差异的观点。“大板红”板栗果实中己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇为其主要香气成分；“冀栗1 号”板栗果实中乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇为主要香气成分；“燕山早丰”板栗果实中己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇为主要香气成分。这与草莓、杏、柑橘和猕猴桃上的研究一致[21-25]。同时，还在“大板红”板栗果实中检测出乙酸丁酯、乙酸己酯2 种酯类物质，这些成分的嗅觉阈值很低，其香气值（浓度/阈值）很高[26]，对果实的香味也有重要影响，但在其他两个板栗品种中均未检测到这两种物质，因此，乙酸丁酯和乙酸己酯有可能是“大板红”板栗的特有香气物质。“燕龙”板栗中丁内酯、糠醛和5-（羟甲基）-2-糠醛的含量较高[3]，王文艳等[20]研究发现板栗生粉中己醛和二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃酮的含量很高。本研究中“大板红”、“冀栗1 号”及“燕山早丰”3 个品种同时检测到的芳香成分有10 种，各个品种果实中均含有3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇等重要的芳香成分，但相对含量存在差异。Krist 等[5]和 Morini 等[17]在板栗中检测出 3-羟基-2-丁酮、甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪3 种物质，认为该3 种物质为烤板栗和煮板栗的主要香气成分。叶兴乾等[18]在糖炒板栗中有检出2-戊基-呋喃，该物质具有果香、青香的香气。本试验虽然在“大板红”和“冀栗1号”中也检测到该物质，但相对含量很低，“燕山早丰”中没有检测出，可能跟板栗果实的加工处理方法有关。以上结果表明：板栗果实中香气成分的种类及其相对含量的异同使不同品种果实既具有板栗果实基本的香味特征，又具有各自独特的香味特点。为此，根据其特有的香气成分，或可为品种或种群的划分提供依据，具体方法有待进一步深入分析。