生物节律对动物生理营养及物质消化利用调控的研究进展

张春桃，马 涛，屠 焰，刁其玉

(中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点开放实验室，北京100081)

大自然为每一种生物都安排了一张“作息表”。猪、牛和羊等家畜总是在白天活动，而猫头鹰善于晚上活动，动物的这种时间观念受体内类似时钟的结构——生物钟的调控，是生命体对地球自转产生的昼夜更替现象所作出的主动适应性反应。机体的生理功能、营养代谢及行为活动与存在于分子、细胞、组织、器官和动物整体水平的昼夜节律密切相关[1]。昼夜节律的紊乱会加大诱发一系列代谢性疾病的可能性，如引发糖尿病、肥胖、消化道疾病等[2]。生物钟对机体代谢稳态的调节及机制已经成为畜禽养殖的研究热点之一。根据动物在白天和夜晚对营养需求量的不同，以及对营养物质的消化、吸收和利用率的不同，给予精准饲养，不仅可以提高饲料利用率，最大程度地发挥其生产性能，而且还可以促进动物健康，提高养殖效益。

1 生物节律与生物钟概述

机体在维持内环境稳态和对外环境适应的过程中，各种功能活动常按一定的时间顺序发生周而复始的节律性变化，称为生物节律。有按年、按月、按周变化的低频节律，也有按日变化的高频节律。生物节律的构成包括两个方面：一是机体本身具有的内在节律；二是受自然环境变化的影响，生物节律与环境同步。2017年诺贝尔生理或医学奖授予了3位深入钻研生物钟的科学家杰弗里·霍尔(Jeffrey C. Hall)、迈克尔·罗斯巴殊(Michael Rosbash)以及迈克尔·杨(Michael W. Young)，表彰他们发现控制昼夜节律的分子机制。目前，认为哺乳动物的生物钟系统由中枢生物钟和外周生物钟共同调控[3]，中枢生物钟主要位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)，而外周生物钟广泛分布于机体各种组织、器官(包括心、肺、肾、胰腺、肝、胃肠道、平滑肌和脂肪组织等)内[4]，并具有各自独立的生物钟。中枢生物钟通过视网膜-下丘脑通路接收光线刺激信号，也可以接收由其他自主神经传输的非光线刺激的生理信号，如激素、食物、温度、药物刺激等，这些信号经过视交叉上核的整合后通过神经传导及内分泌调节等方式传到下游的大脑区域及外周生物钟，进而协调其功能，控制着机体新陈代谢、行为和免疫等各项生命活动的进程，维持昼夜节律稳态并调节组织特异性基因的表达[5]。当昼夜节律失调，外周生物钟可以重新调整其相关基因的表达，使整个机体水平达到共振。总之，中枢生物钟是节律的起搏点，它可以通过某些机制联络散在的波动源形成一个昼夜节律网络，各个联络点的节律既彼此独立又相互影响，共同维持机体内环境稳态(图1)。

2 生物钟的调控基因

生命系统拥有极其精确的内部生物钟，调节昼夜节律生物钟的分子机制极其复杂。近年来，科学家们对哺乳动物生物钟的分子机制展开了系列研究，发现在哺乳动物的主要时钟基因由正调控因子CLOCK、BMAL1、NPAS2和负调控因子PER(Per1、Per2、Per3)、CRY(Cry1、Cry2)、REV-ERBɑ等[7]组成，这些基因构成机体自动调节的正负反馈转录网络。

1) 正向调节：CLOCK、NPAS2和BMAL1作为核心转录调控因子对动物机体的生理功能、生化代谢和行为活动等具有重要的调控作用，它们通过PAS结构域形成异源二聚体CLOCK:BMAL1或NPAS2：BMAL1，并与靶基因PERs、CRYs、REV-ERBɑ、RORɑ上游E-box受体结合启动转录，激活周期家族基因PERs和隐色素基因CRYs及REV-ERBɑ的表达，进而翻译产生生物钟蛋白，参与生物钟调节。该通路为生物钟的分子基础，例如CLOCKΔ19基因突变或缺失可导致肝、肌肉和胰腺中主代谢基因的节律性表达丧失，继而引发高脂血症、高瘦素血症及葡萄糖和脂质稳态失衡，表现出日摄食节律减弱、肝脂肪变性、胰岛素分泌功能受损，导致摄食过度和肥胖[8]；BMAL1作为CLOCK基因的异二聚合体配合体，它的突变除了引起心律失常外，还会打破肝碳水化合物代谢及糖和脂质代谢平衡等。

2) 负向调节：①CRY和PER编码产生的蛋白，在经酪蛋白激酶(CKIε)磷酸化后形成稳定的PER:CRY异二聚体(即为负调节因子)在细胞质中聚集，当浓度超过一定界限时PER:CRY复合体转移至细胞核内，抑制CLOCK:BMAL1异源二聚体介导的转录。如CRY1腺病毒过表达可抑制CLOCK:BAML1的转录活性，降低胰岛素抗性，改善肝糖异生基因表达，使血糖水平恢复正常。此时，基因PER和CRY的转录不受CLOCK:BMAL1激活剂刺激的影响，细胞核内PER和CRY蛋白水平降低，当下降到一个临界低阈值时负调节结束，进入下一轮新循环，从而产生转录物和蛋白水平的振荡变化，持续约24 h。②另外一组负反馈通路由BMAL1、REV-ERBɑ和RORɑ组成。核受体REV-ERBɑ和RORɑ既是CLOCK:BMAL1异二聚体的靶基因，也可反向调节其转录活性。REV-ERBɑ蛋白可与BMIL1启动子结合，抑制BMIL1转录[9]。而RORɑ可与REV-ERBɑ蛋白竞争BMAL1的启动区[10]，促进BMAL1转录。由此可知REV-ERBɑ是连接正负调节的中介因子。例如，敲除REV-ERBɑ的小鼠食欲过盛，会导致肥胖、高血脂和高血糖等代谢疾病发生，因此，添加REV-ERBɑ抑制剂能降低组织中脂肪含量并有效改善血脂异常和高血糖症[9]，负反馈调节BMAL1转录活性，使机体血糖及脂质代谢恢复正常水平。

综上表明：昼夜节律正是在生物钟控基因形成的复杂体系精密调控下，形成了以24 h为周期的节律性振荡。这种分子振荡不但使核心节律基因的转录活性呈现节律性的特征，同时也使受节律基因调节和控制的下游钟控基因及重要功能蛋白呈节律性表达，从而调控机体生理功能(图2)。

3 生物钟对营养生理代谢的调控

生物钟系统参与调控糖脂等营养物质的代谢过程，对维持机体正常生理功能发挥着重要作用，对糖脂代谢产生的影响主要有2个方面：1)中枢生物钟调控糖脂代谢基因，通过BMAL1、CLOCK和NPAS2基因的反馈调节影响葡萄糖转运载体(GLUT)、脂肪酸合成酶(FAS)和脂肪结合蛋白(FABP)等基因[10]；2)外周生物钟通过神经和体液调控动物机体各个部位生物钟，使其与中枢生物钟协同合作参与机体的糖脂代谢[11]。

3.1 生物钟对糖代谢的调控

糖类作为机体最基本的能量物质，血糖浓度在一天中是动态变化的。在人和啮齿动物中，进食/禁食、睡眠/觉醒、运动/静止等生命活动虽引起葡萄糖的摄取利用的变化，但血液中葡萄糖的浓度始终是夜间高于黎明，这是由于机体存在内源性自我稳态调控机制，这就是我们熟知的“黎明现象”[7]。因此，推测机体内存在内源性葡萄糖昼夜代谢节律。Morris等[12]通过模拟行为和环境对葡萄糖耐量的影响发现，与行为/环境等综合因素相比，生物钟系统对葡萄糖的耐量影响极为显著，表明生物钟对健康个体葡萄糖代谢具有很强的调控作用。葡萄糖代谢的昼夜节律控制也被证实，但其中涉及的分子机制还处于讨论之中。有研究表明，敲除CLOCK或BMAL1基因会使小鼠胰岛素分泌减少和葡萄糖耐量异常[8]。当小鼠出现SCN受损、CLOCK突变和BMAL1缺陷时，葡萄糖耐受力和胰岛素敏感性也会受到影响，对相关机制的研究发现，“黎明效应”中SCN-室旁核-自主神经系统轴可能在肝糖原输出的昼夜节律中发挥重要作用。

在啮齿动物和人类中的研究表明，葡萄糖代谢昼夜节律性的丧失甚至可能导致代谢紊乱(如Ⅱ型糖尿病的发展)，因为在糖尿病大鼠和Ⅱ型糖尿病患者中，胰岛素分泌节律、葡萄糖耐量和皮质酮释放减少[13]。在单胃动物方面，Gao 等[14]通过探究每日饲喂 2 种不同钙水平日粮对妊娠母猪胎盘糖脂代谢和运输的影响，发现高钙-低钙组和低钙-高钙组抑制胎盘中 per2的 mRNA 表达，降低葡萄糖转运载体(GLUT)活性，进而影响猪胎盘糖代谢和转运。对反刍动物而言，其体内90%的葡萄糖由肝糖异生产生，日粮中的碳水化合物经瘤胃降解后产生的生糖氨基酸由肝糖异生途径合成葡萄糖，产奶动物在产乳旺盛期对葡萄糖的利用率高达85%[15]，这也是反刍动物发生能量负平衡的主要原因之一。因此，更好地理解葡萄糖体内平衡和其他生理过程昼夜节律控制的分子机制对于代谢疾病的诊断以及畜牧养殖是至关重要的。

3.2 生物钟对脂代谢的调控

脂肪(如三酰甘油)是体内主要的储能物质，脂质代谢也呈现出明显的昼夜节律以满足机体对能量的需要，昼夜节律计时系统在调节脂质代谢中起着关键作用，促进脂质吸收、储存和运输的昼夜节律与休息活动及摄食周期在时间上协调一致。在细胞水平上，参与脂质合成和脂肪酸氧化的基因被核心时钟蛋白以一种组织特异性的方式节律性地激活和抑制。因此，生物钟基因功能的丧失或昼夜节律与摄食周期的失调(如轮班工作)会导致脂质稳态受损。

生物钟通过调控脂肪合成和分解代谢过程中一些特定酶来维持机体脂质代谢平衡。在野生型小鼠中，脂肪三酰甘油脂肪酶和激素敏感脂肪酶基因直接被CLOCK:BMAL1转录复合物激活。在CLOCK突变小鼠中，这些限速脂肪分解酶的基因水平降低，这可能是导致这些动物白色脂肪组织中脂质积累增加的原因，可见，核受体激活的昼夜节律也可能在脂肪组织中核心时钟蛋白与脂质代谢功能的耦合中发挥重要作用。目前,对于基因缺陷型动物的研究中发现，REV-ERBɑ在调节机体糖脂代谢、脂肪细胞形成等方面发挥重要作用，REV-ERBɑ和组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)共定位于100多个脂质生物合成基因，包括脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶和甲状腺激素诱导的肝蛋白，敲除小鼠肝REV-ERBɑ或HDAC3可引发肝的脂肪变性[16]。这些研究表明，核心时钟蛋白通过激活或抑制参与脂质代谢相关基因，直接或通过调节其他转录因子的循环来调节脂质代谢途径。

生物钟在对脂肪代谢的调控起重要作用。研究发现，只在12 h光照期喂食高脂肪食物的夜间活动小鼠比只在12 h黑暗期喂食高脂肪食物的小鼠体重明显增加[17]，这可能与小鼠的生物规律夜间活动有关。因为大部分脂肪储存在脂肪组织中，脂肪的调节激素表现出昼夜变化节律，包括食欲抑制剂瘦素，其向下丘脑中的食欲回路发出餐后饱腹感信号，以减少食物的摄入。Wu 等[18]研究发现，在两种不同的饲喂模式下，与对照组(日粮蛋白质水平为中-中-中)相比，试验组(日粮蛋白质水平为高-中-低)猪的平均日增重(ADG)显著增加了14.75%，可能是试验组与肉的风味相关的生糖氨基酸(蛋氨酸、丝氨酸)含量增加，并通过三羧酸循环生成脂类，提高生长性能。因此，研究生物钟可以有效了解畜牧生产力。

4 生物钟对消化器官及功能的调控

消化系统是一个十分复杂的动态变化体系，包括消化腺(肝、胰腺)和消化道(胃肠道、瘤胃)，食物的消化吸收需要通过消化系统各器官的协调配合来完成。食物中的营养素主要包括碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、无机盐和水。除了维生素、无机盐和水可以直接吸收，蛋白质、脂肪和碳水化合物都是复杂的大分子有机物质，不能直接吸收，它们必须首先在消化道分解为简单的成分。这一系列的生理活动亦受生物钟调控。①在肝中：Wang等[19]利用蛋白质组学技术SILAC结合量化蛋白质组学方法，发现了肝中500多种受生物钟调控的蛋白，它们参与调控的诸多功能，如碳水化合物、氨基酸、脂类和胆汁酸的代谢，以及解毒酶、激素、胆汁成分和凝血因子的合成均具有昼夜节律性。Pullen等[20]研究发现，肝是糖脂代谢的主要器官，调控乳成分前体物生成与分配，从而决定了乳品质与产量，有研究表明，肝摄入的游离脂肪酸与血中游离脂肪酸的含量呈正相关，而乳脂的合成水平取决于肝输出的游离脂肪酸水平。②在胰腺中，胰岛素和胰高血糖素的分泌都受生物钟的控制，Bmal1基因敲除可抑制机体胰岛素释放[21]，但在反刍动物方面目前还没有相关研究，如何全面深入了解昼夜节律与胰腺分泌之间的互作机制，提高反刍动物生长性能还有待研究。③此 外，微生物群落的组成和功能也遵循与宿主生物钟同步的昼夜节律性，胃肠道与微生物群落密切合作，发挥众多代谢和内分泌功能。Shaani等[22]通过交叉试验，分别于早上6：00和晚上17：00采集瘤胃液，体外发酵48 h，发现晚上的瘤胃微生物代谢力更强，具有更好的甲烷生成潜力，那么我们可以推测，当同一瘤胃群落处于不同的代谢环境中，其微生物丰度和功能也会发生改变。总之，机体内各个组织器官组织之间相互合作又分工明确，且与生物钟之间的相互协调，使生命活动处于相对平衡状态。生物钟一旦被打破可导致代谢紊乱，生物钟紊乱对外周器官的影响见表1。

表1 生物钟紊乱对外周器官的影响

4.1 生物钟对瘤胃菌群与瘤胃内环境的调控

微生物菌群可调节宿主的营养消化吸收、新陈代谢、机体免疫，甚至宿主行为和认知功能等生理过程，且这些生理过程都具有一定的节律性。Thaiss等[5]通过调节小鼠光照时间和饮食时间，发现具有昼夜节律的菌群占总菌群组成的60%左右。它们在受宿主因素影响的同时，也能参与宿主生命活动的调节。菌群紊乱将引起菌群结构和功能的失调，进而导致机体营养代谢、胃肠道发育、DNA修复等方面丧失昼夜节律性。

瘤胃是迄今已知的降解纤维物质能力最强的天然发酵罐，使反刍动物能够降解多种饲料成分和代谢物，反刍动物必须依赖瘤胃内复杂的微生物降解植物性饲料而获得生长所需的能量和营养物质。瘤胃菌群主要包括瘤胃原虫、细菌、真菌等。瘤胃内环境主要指的是酸度(pH)、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)等。当环境条件(进食时间、饲粮形态与组成、温度等)恒定时，瘤胃菌群的组成、功能及瘤胃内环境的变化便呈现出特定的规律性[22]。Khafipour等[25]发现饲喂的精料过高能显著上调瘤胃生物钟BMAL1、PER1、CLOCK和tRNA基因的表达，同时，也会损伤瘤胃上皮组织，使瘤胃酸度发生改变，影响VFA的吸收。当瘤胃生物钟节律发生变化，破坏了瘤胃最适pH，就会影响一系列消化酶(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等)和非消化酶(纤维素酶、果胶酶等)的活性，酶的催化作用受到抑制。Shaani等[22]对16头荷斯坦奶牛瘤胃微生物进行取样，取样时间分别是喂食前1 h(06:00)、喂食后4 h(11:00)、喂食后7 h(14:00)和喂食后10 h(17:00)，发现拟杆菌丰度从喂食前1 h的43%下降到喂食后10 h的13%，厚壁菌门、广布菌门和放线菌显著增加，厚壁菌门和拟杆菌门的比率从早上到晚上增加了6倍，说明瘤胃菌群随喂食时间的增加显著变化。此外，热应激会抑制瘤胃微生物的生长。迄今为止，在时间轴上对瘤胃微生物群落昼夜节律性的研究少见报道。在评估瘤胃发酵终产物时，瘤胃微生物代谢的昼夜动态通常被忽略，因此，今后需进一步试验去深入探究生物钟与瘤胃菌群昼夜代谢及内环境变化之间的互联机制。

4.2 生物钟对胃肠道功能的调控

近年来，许多报道显示，昼夜节律调控着胃肠道的许多功能，胃肠道运动也遵循着这些规律。①在胃的运动方面，早在1987年就有学者发现同一个体晚8:00进食同样饮食后的排空率明显要比早8:00慢[26]。Lindberg等[27]对30名志愿者进行动态胃电图检测，发现中午的平均频率显著高于深夜，具有明显的昼夜变化，说明胃肠运动受生物钟的调控。②在小肠运动方面，Kumar[28]通过双腔测压导管观察近端小肠的移行性复合运动，他发现健康人白天和黑夜之间移行性复合运动(MMC)传播速度存在可观的差异性，但在肠易激综合征(IBS)患者中是无差异的。③在结肠和直肠运动方面，一些健康志愿者肠道动力的试验研究已证实肠道运动有昼夜节律的变化，且结肠、直肠在夜间运动弱于白天。④胃肠道激素分泌也具有昼夜节律性，调节胃酸分泌的促胆囊收缩素、促胃液素等下丘脑肽类物质的合成具有生物节律性。

生物钟可横跨“时间和空间”变化，如倒时差、熬夜的人群易出现胃肠道不适，出现食欲不振、便秘、消化不良等症状。但是生物钟作为胃肠运动调节因素的具体作用机制仍不明确，需进一步探究。

5 生物钟对动物的影响

地球自转所带来的环境变化中最明显且持续的信号因子是光周期变化，因此光照被认为是对机体影响最大因素，人们一直从日粮营养、饲养管理条件及生物调控技术等方面来提高家畜的生产性能。然而改变昼夜节律中白天光照时间，对家畜的行为活动、新陈代谢、生长发育具有一定的影响。有研究指出，给予断奶仔猪长光照，可促进其日采食量和提高日增重，减少维持能量，提高能量利用率和饲料转化效率[29]。表明光照时间可以作为促进断奶仔猪采食量的一种方法。Martelli 等[30]设置两组光照时长(8、16 h 光照)，发现延长光照提高了猪的生产性能，而两组间的肉品质及皮下脂肪的脂肪酸组成差异不显著，说明即使在较低光照强度下，适当延长光照时间有助于育肥猪生长，且对动物行为健康及动物产品无不利影响。李胜利等[31]研究发现不同光照条件显著影响试验羊的营养物质表观消化率，日粮能量水平相同条件下，短光照条件下试验羊的DM、NDF和CP表观消化率均高于长光照。Lacasse等[32]研究表明，在干奶期，短光照组与长光照组相比可显著增加经产奶牛泌乳前期产奶量的10.9%和7.6%，这是由于短光照下能够促进乳腺生长，提高生产性能。

根据动物自身生理节律特点来调整营养结构及光照时间，可达到低碳氮减排、节约饲料成本和提高动物生产性能的目的。表2、3汇总了近几年国内外关于生物钟或光照周期对动物影响的研究进展。

表2 生物钟或光照周期对单胃动物的影响

表3 生物钟或光照周期对反刍动物影响的研究进展

由表2、3可以看出，人们开始利用动物生物钟的调控作用，遵守自然规律，给生产带来效益。生物钟的研究不仅应用于动物产品方面，而且在调整人们生物钟仪器和药物的开发、食谱的改良、疾病及癌症的治疗等方面应用广泛。在如今快节奏的生活中，人们生活作息越来越不规律，长期轮班工作或经常倒“时差”容易造成体内生物钟紊乱，对营养代谢有多重不利影响。因此，长期的作息不规律使得患肥胖症、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的风险明显增高，此外，昼夜节律的紊乱也会引发肠胃不适，甚至诱发结肠直肠癌或其他代谢性疾病。为此，从生理指标、行为学、基因表达等方面进行综合评价，明确不同营养配制及饲喂技术对动物表现性状的影响，有利于把效率和营养素利用率提高。

6 生物钟被调控的因素

生物钟虽然具有内源性机制，机体生物钟的相位与外界环境信号同步，但同时也受环境因素如光照、温度、运动、饮食(营养物质、饲喂模式)等的影响。

在哺乳动物中，饮食信号已被证明是除光信号外最有效的生物钟授时信号。营养成分(氨基酸、葡萄糖等)、饲喂模式可诱导外周器官、脑组织中的生物钟基因在表达时脱离母钟SCN的控制，从而形成由食物信号引起的相对独立的外周生物钟节律，实现重置生物钟时相。葡萄糖、氨基酸等营养物质作为机体能量的主要来源，它能引起中控基因的相对位移，实现对生物钟的调控。Iwanaga等[40]在给禁食引起的低血糖大鼠注射葡萄糖后，发现SCN和肝中PER2的表达峰值都发生了移动，此外又通过对另一批大鼠颈静脉注射氨基酸混合物后也得出相同的结果，这说明葡萄糖和氨基酸均可显著调控生物钟。

限时采食也有助于维持一个稳定的生物钟系统，通过基因PER1/2双敲除试验发现，当宿主的昼夜节律发生紊乱后将直接打破肠道菌群昼夜波动的节律性，引起菌群的组成和功能两方面的改变。对此类小鼠给予长时间规律性饮食后检测菌群的组成发现，调控进食节律可纠正由于宿主生物节律破坏而引起的菌群失调。另有研究发现，抗生素诱导的肠道菌群失调会导致肠上皮细胞的昼夜节律振幅减弱[41]。菌群节律波动是一个过程，与宿主行为的昼夜节律及微生物群组成存在一定的关联。

新陈代谢既是生物钟调节的输出，也是生物钟的重要输入。研究表明，这种输入-输出反馈调节机制为生物生命活动提供必要的伸缩性，来调节生理活动以适应细胞、组织和整个生物体的代谢需求。

7 小 结

生物钟系统普遍存在于生命体的各级水平，参与生命活动的生理过程，生物钟系统对机体营养和代谢方面的调控作用非常广泛，属于现代生命科学研究中的重大基础理论，利用动物机体在一个周期中对营养物质消化、吸收和利用的节律性进行科学精准饲喂，不仅可以提高营养素的利用，同时，还最大程度地发挥其生长性能，促进动物健康，提高养殖效益。对于动物营养学科，如何根据不同动物的生物钟或生物节律，发挥动物本身的作用，调控营养物质的利用效率，提高动物的生产性能，有着重要的理论价值和实际意义，有待开展一系列的试验研究，进一步揭示其中的奥妙，建立一个协调的动物与营养及环境的平衡机制。