新城疫病毒M蛋白细胞核定位的机制与功能研究进展

段志强，谢玲玲，周 迪，王燕碧，赵采芹，唐 宏

(1. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵阳 550025；2. 贵州大学动物科学学院，贵阳 550025； 3贵州省种畜禽种质测定中心，贵阳 550018)

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属于单负链病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒亚科(Avulavirinae)、正禽腮腺炎病毒属(Orthoavulavirus)成员，是一种严重危害世界家禽养殖业的重要病原之一[1-2]。NDV含有一条单股负链不分节段的基因组RNA，其基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，可编码6种结构蛋白(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)和2种非结构蛋白(P基因经过RNA编辑产生的V蛋白和W蛋白)[3]。与其他副黏病毒M蛋白一样，NDV M蛋白同样位于病毒囊膜内表面，构成病毒囊膜和核衣壳连接的支架，在病毒粒子的组装和出芽过程中发挥核心作用[4-5]。虽然NDV主要在细胞质中完成病毒基因组的复制、转录、蛋白质合成以及病毒的组装，但是其基因组编码的M蛋白和W蛋白却能在病毒感染早期通过自身携带的核定位信号(nuclear localization signal, NLS)进入细胞核[6-7]。近年来，研究人员分别对M蛋白和W蛋白NLS关键碱性氨基酸位点进行突变，结果发现，NLS突变均导致两个蛋白由细胞核定位变为细胞质定位，但是M蛋白NLS突变显著降低了病毒的复制和致病性[8]，而W蛋白NLS突变却不影响病毒的复制和致病性[7]，暗示了M蛋白细胞核定位的重要性。此外，基于水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)、人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)和麻疹病毒(measles virus, MeV)M蛋白细胞核定位的功能研究结果[9-11]，研究人员推测NDV M蛋白的细胞核定位有利于细胞质中病毒基因组的复制和转录，并且可能会抑制细胞基因的转录和蛋白质合成。鉴于M蛋白在NDV生活周期中的重要作用，本文结合课题组近些年对M蛋白细胞核定位的相关研究，主要从NDV M蛋白的细胞定位特征、M蛋白细胞核定位的分子机制和功能方面进行综述，以期为NDV M蛋白细胞核定位的相关功能研究提供参考。

1 NDV M蛋白细胞定位特征

早在1988年Faaberg等[12]用M蛋白单克隆抗体检测NDV感染细胞后的M蛋白分布，发现M蛋白能够定位在细胞核中。由于当时的观点认为副黏病毒主要在细胞质中完成其生活史，病毒蛋白没有进入细胞核的必要，所以M蛋白可能只是积聚在细胞核膜表面，而不是进入了细胞核。为了进一步研究M蛋白的细胞定位，使用不同浓度的表面活性剂处理细胞，还是发现M蛋白能够定位在细胞核[13]。随后有研究证实，在没有其他病毒蛋白存在的情况下，质粒单独表达的M蛋白同样聚集在细胞核中，并且还能定位在核仁[14]，由此确证了NDV M蛋白的细胞核定位特征。因为NDV子代病毒粒子的组装和出芽需要在细胞质和细胞膜进行，并且需要M蛋白的参与，通过间接免疫荧光试验发现在NDV感染后期M蛋白由细胞核进入了细胞质[14-15]，因此，证实了NDV M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。

蛋白质核质穿梭主要是由蛋白质自身携带的NLS和核输出信号(nuclear export signal, NES)所介导[16-18]。猿猴空泡病毒40(Simian virus 40, SV40)大T抗原NLS是第一个被鉴定的由单簇碱性氨基酸组成的NLS(126PKKKRKV132)[19]，随后研究还发现由两簇碱性氨基酸组成的非洲爪蟾核质蛋白NLS(155KRPAATKKAGQAKKKK170)[20]；而NES则是由一段富含疏水性的氨基酸(如亮氨酸L、异亮氨酸I、缬氨酸V)组成，如人免疫缺陷病毒1型Rev蛋白NES(73LPLPPLERLTL83)[21]。通过对NDV M蛋白氨基酸序列进行比对分析和氨基酸点突变，研究证实了M蛋白中存在1个由两簇碱性氨基酸组成的NLS[6]和3个由疏水性氨基酸组成的NES[22]介导M蛋白的细胞核-细胞质穿梭(图1)。NLS介导的M蛋白入核需要在核转运受体蛋白importin β1和RanGTP的帮助下完成[8]，但是迄今为止，国内外尚未鉴定出与M蛋白NES相互作用的核输出受体蛋白。另外，在NDV感染细胞期间M蛋白都能定位在核仁，研究发现主要是由M蛋白氨基端(aa 30—60)与核磷蛋白B23羧基端(aa 188—245)发生相互作用进入细胞核仁[23]。因此，M蛋白aa 30—60可能是假定的核仁定位信号(putative nucleolar localization signal, pNoLS)(图1)，这与Coleman等[6]的研究结果相一致，但是决定M蛋白核仁定位的关键氨基酸位点还有待确证。以上研究结果表明，NDV M蛋白中存在NLS、NES和pNoLS分别介导了M蛋白的细胞核定位、细胞质定位以及核仁定位。

2 NDV M蛋白细胞核定位的分子机制研究进展

蛋白质进入细胞核除了需要自身携带的NLS，还需要核转运受体蛋白的参与。核转运受体蛋白是一类与核孔选择性运输有关的蛋白质分子，包括importin α和importin β两个家族成员，它们可以联合识别和结合靶蛋白中携带的NLS，协助靶蛋白进入细胞核[16,24-25]。但是，有研究证实importin α或importin β单独介导的靶蛋白入核转运效率要高于importin α/β共同介导的靶蛋白入核转运[26-27]。近期，课题组通过酵母双杂交系统从鸡胚成纤维细胞中筛选到NDV M蛋白与核转运受体蛋白importin β1存在相互作用，免疫共沉淀和pull-down试验证实M蛋白通过其NLS区域与importin β1 aa 336—433(第8—10 HEAT Repeats，也是RanGTP结合区域)发生相互作用[8]。随后的荧光共定位和洋地黄苷透化的HeLa细胞试验结果发现，M蛋白的入核转运需要importin β1和RanGTP的共同参与[8]。有研究表明importin α 可以在importin β1 单独介导的靶蛋白入核转运过程中发挥抑制作用，利用免疫共沉淀和pull-down试验发现importin α5 可以通过结合importin β1 与NDV M 蛋白发生相互作用[8]。进一步的研究发现，RNAi干扰importin β1蛋白的表达减少了M蛋白的细胞核定位，并且降低了NDV的复制能力和致病性：而干扰importin α5蛋白的表达却增加了M蛋白的细胞核定位，并且增强了NDV的复制能力和致病性[8]。通过上述研究结果，可以确定核转运受体蛋白importin α5 和importin β1 对M蛋白的入核转运以及NDV的复制和致病性的影响机制：核转运受体蛋白importin β1 与NDV M 蛋白在细胞质结合形成二元复合物，进入细胞核后通过RanGTP 作用而解离，停留在细胞核中，这个过程有利于加快M 蛋白的入核转运速度以及促进NDV的复制和致病性(图2A)；而细胞质中的importin α5 可以通过结合importin β1 与M 蛋白发生相互作用形成三元复合物，这个过程会减少M 蛋白的细胞核定位，进而影响NDV 的复制和致病性(图2B)。

3 NDV M蛋白细胞核定位的功能研究进展

3.1 M蛋白细胞核定位调节NDV基因组的复制和转录

NDV基因组的复制和转录主要在细胞质中进行，这个过程需要NP蛋白与病毒RNA相互作用并包裹其形成核衣壳，还与P蛋白和L蛋白一起形成核糖核蛋白体，共同调节病毒基因组的复制和转录[28-29]。对仙台病毒(Sendai virus, SeV)、VSV和HRSV M蛋白的研究发现，在病毒早期感染过程中M蛋白在细胞质中可以通过与NP蛋白相互作用抑制病毒RNA聚合酶活性，从而抑制从病毒基因组转录到包装成病毒粒子信号的转换[30-32]。另外，在VSV和SeV核衣壳中额外加入M蛋白可以降低病毒RNA的转录能力[31, 33]。有研究证实NDV M蛋白与NP、HN和F蛋白存在相互作用[4]，这对病毒蛋白包装成病毒样颗粒有重要作用。最近课题组将NDV微型基因组质粒与表达M蛋白或M蛋白NLS突变的质粒分别共同转染细胞，结果发现由于M蛋白NLS突变导致M蛋白不能进入细胞核，从而降低了病毒基因组复制和转录水平[34]。进一步拯救的亲本病毒(rSS1GFP)和M蛋白NLS突变体病毒(rSS1GFP-M/NLSm)分别感染细胞，同样发现rSS1GFP-M/NLSm在细胞中的病毒基因组复制和转录水平明显减低[34]。因此，可以确定的是M蛋白在NDV感染早期进入细胞核能够保证细胞质中病毒RNA的复制和转录达到一定的水平，然后M蛋白返回到细胞质参与病毒粒子的组装，这个过程对NDV完成正常的生活史具有重要意义。

3.2 M蛋白细胞核定位抑制细胞基因的转录

病毒M蛋白在细胞核中能抑制宿主细胞基因的转录，在多种病毒如VSV、HRSV、MeV、SV40、流感病毒(influenza virus, IV)、狂犬病病毒(rabies virus, RV)、病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)等已经得到证实，但是其作用方式可能存在差异。例如，MeV M蛋白在细胞核中能结合转录相关因子，并且以剂量依赖的方式抑制细胞基因的转录[11]；VSV M蛋白在细胞核中能抑制细胞3种类型RNA聚合酶的转录活性，并能灭活细胞核中重要的转录起始因子如TATA结合蛋白、转录因子ⅡE和ⅡH等，达到抑制细胞基因转录的目的[9,35]；而VHSV M蛋白能抑制基因启动子招募RNA聚合酶Ⅱ，并且抑制3种类型RNA聚合酶的转录活性[36]。

目前，在副黏病毒M蛋白抑制细胞基因转录方面的研究报道仍然较少。为了解NDV M蛋白是否具有抑制细胞基因转录的功能，课题组利用转录组学研究亲本病毒rSS1GFP和突变体病毒rSS1GFP-M/NLSm分别感染细胞后的差异表达基因，结果发现与rSS1GFP-M/NLSm相比，亲本病毒rSS1GFP感染细胞早期导致的大量上调基因主要与细胞转录抑制活性有关，而下调基因主要与DNA结合或RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性以及转录激活活性有关[34]。进一步通过TMT定量蛋白质组学研究发现，亲本病毒rSS1GFP感染细胞早期，与细胞基因转录、RNA加工和修饰相关的蛋白表达量明显降低，而在病毒感染晚期这种抑制作用减弱，但是突变体病毒rSS1GFP-M/NLSm感染细胞期间相关蛋白的表达量并没有明显变化[37]。另外，在rSS1GFP感染细胞早期，与细胞RNA转运、RNA降解、RNA聚合酶、基础转录因子、剪接体和mRNA监视相关的大多数蛋白均表现为下调[37]。此外，有研究报道M蛋白在细胞核中与细胞基因转录相关的基质蛋白3、含溴结构域蛋白2(bromodomain-containing protein 2, BRD2)发生相互作用[38-39]，并且M蛋白与BRD2相互作用能降低该蛋白的表达，这个过程可以促进NDV基因组的复制和转录[39]。以上研究结果表明，NDV感染细胞早期M蛋白在细胞核中能通过多种形式抑制细胞基因的转录。

3.3 M蛋白细胞核定位影响细胞蛋白的表达

NDV感染细胞后能够快速抑制细胞内蛋白多肽的积累且增加病毒特异性蛋白多肽的合成[40]，但是这种作用机制并不清楚。近年来，研究人员发现NDV感染细胞后能形成应激颗粒(stress granule, SG)，通过PKR/eIF2α信号通路诱导稳态SG形成，该SG可以特异性招募细胞mRNA，而病毒mRNA则逃逸出SG的包裹，以此影响细胞蛋白的翻译和合成[41]。另外，NDV感染细胞后，细胞的真核翻译系统以及相关的PI3k/Akt/mTOR和p38 MAPK/Mnk1通路迅速被激活，并且NDV NP蛋白与细胞翻译起始因子eIF4E直接结合，抑制以1型帽子结构为主的细胞mRNA翻译，优先翻译NDV 0型帽子结构的mRNA[42]。然而，对于NDV M蛋白是否参与抑制细胞蛋白的翻译过程仍不清楚。核磷蛋白B23蛋白是一种多功能核仁蛋白，其羧基端的核苷酸结合结构域在细胞中主要涉及核糖体的成熟和装配，破坏这个区域能抑制细胞内蛋白质的翻译过程[43-45]。NDV M蛋白能与B23蛋白核苷酸结合结构域发生相互作用，并且在NDV感染期间能破坏B23蛋白的正常定位[23, 46]。因此，M蛋白可能通过与B23蛋白相互作用并且破坏其结构和功能来影响细胞的翻译。

利用蛋白质组学技术研究发现，相比M蛋白NLS突变体病毒rSS1GFP-M/NLSm，亲本病毒rSS1GFP感染细胞早期与细胞蛋白翻译相关的核糖体蛋白表达量显著降低，而在感染后期核糖体蛋白表达量才开始上升[37]。另外，在rSS1GFP感染细胞早期，与细胞mRNA核输出相关的蛋白，如转录和mRNA输出因子(transcription and mRNA export factor, ENY2)、THO复合物亚基2(THO complex subunit 2, THOC2)、核帽结合蛋白亚基2(nuclear cap-binding protein subunit 2, NCBP2)、核孔复合蛋白153(nuclear pore complex protein 153, NUP153)、丝氨酸/精氨酸剪接因子3(serine/arginine-rich splicing factor 3, SRSF3)，表达量明显下降[37]。因此，根据以上研究结果可以推测，M蛋白在细胞核中可能通过影响细胞基因的转录、mRNA核输出、核糖体蛋白的表达以及核仁蛋白的功能达到抑制细胞蛋白翻译的目的。

4 展望

RNA病毒包括双链RNA病毒、单股正链RNA病毒和单股负链RNA病毒，是一类极其重要的病原体，虽然它们的M蛋白同源性不是太高，但从已报道的研究结果可以发现M蛋白具有许多相似的生物学功能，这为NDV M蛋白的功能研究提供了一定的借鉴和参考。目前，国内外对NDV复制和致病性的研究大多集中在F、HN、NP和V蛋白，而对M蛋白的研究则主要是在M 蛋白与NDV 毒力和复制的关系以及以M 蛋白为核心的病毒样颗粒形成机制和利用方面[47]。大多数副黏病毒M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白[48-49]，而对于M蛋白细胞核定位的分子机制和功能研究仅见于尼帕病毒和SeV[48, 50]，但主要还是以泛素化所介导的M蛋白核输入。最近姜维雨[51]也发现NDV M蛋白K119和K260存在泛素化修饰，有助于M蛋白的细胞核定位以及病毒样颗粒的形成和出芽，并且K119发生泛素化修饰减少了与细胞蛋白的相互作用，使M蛋白能顺利从细胞膜释放。因此，NDV M蛋白与核转运受体蛋白发生相互作用或通过碱性氨基酸位点发生泛素化修饰能增加其入核的途径，更有利于M蛋白进入细胞核发挥功能。另外，根据目前已报道的研究结果，虽然NDV M蛋白在细胞核中能抑制细胞基因的转录和影响细胞蛋白的翻译，但主要是基于组学研究结果的推测，并没有直接的证据。因此，NDV M蛋白细胞核定位降低了细胞基因转录和mRNA核输出相关蛋白的表达，它是否能像VSV M蛋白一样与细胞蛋白Rae1-NUP98复合物[52-54]、TFIIH亚基p8[55]相互作用抑制细胞基因转录，或是与核孔复合物蛋白相互作用抑制snRNA和mRNA的核输出[56]，仍然值得我们进一步深入研究。