黄原胶和魔芋胶抑制碱诱导鸭蛋清凝胶的高温液化

范红，艾民珉，曹媛媛，郭善广，龙姣丽，李树长，蒋爱民

（华南农业大学食品学院，畜禽产品精准加工与安全控制技术国家地方联合工程研究中心，广东广州 510642）

鸭蛋蛋清约占全蛋重量的60%，蛋清中的水分约占 88%，蛋白质约占 9.70%～10.60%，其中卵白蛋白约占蛋白总量的 54%，碳水化合物约占 0.50%[1]。常温下，鸭蛋蛋清能在碱的作用下形成富有弹性的凝胶，中国的传统蛋制品皮蛋就是用这个原理加工而成的[2]。但是，经前期试验发现，制备的蛋清凝胶在高温下会出现“液化”现象，这限制了碱诱导蛋清凝胶在食品工业中的应用。有研究表明食品体系中多糖与蛋白质发生交互作用会影响蛋白质的胶凝性、乳化性和起泡性等功能特性[3]，两种大分子物质形成的共混凝胶具有与单纯的蛋白凝胶不一样的物化及功能特性[4,5]。前期用十几种胶体进行试验发现,一定浓度的黄原胶和魔芋胶对于碱诱导鸭蛋清凝胶在高温下的液化有显著的抑制效果。

黄原胶是一种阴离子多糖，分子量在2×106～2×107之间，具有良好的稳定性和增稠性，食用安全性高[6,7]。在水溶液中，黄原胶的主链会被侧链缠绕使主链的β-1,4-糖苷键得到保护而不易受到攻击，从而使其具有耐碱、耐高温、耐酸和抗酶解等特性[8]。1%的黄原胶由25 ℃加热到120 ℃，黏度仅下降3%，pH 2～12黏度几乎不变[5]。魔芋胶是一种中性的植物多糖，由(1-4)-β-D吡喃葡萄糖和β-D吡喃甘露糖按1:1.6的单位摩尔比通过β-1,4糖苷键连接而成的线性无规则共聚物，相对分子量大，水合能力强，是一种食品工业中常用的优良增稠剂[9]，在碱性条件下加热，会脱掉分子链上的乙酰基，可形成热稳定好的凝胶[10]。

目前，对于蛋清凝胶和多糖形成的共混凝胶体系的研究主要集中在多糖对蛋清蛋白的乳化性和凝胶性的影响，刘瑞丹[7]研究发现采用黄原胶和蛋清蛋白微凝胶颗粒制备的结构化油脂具有很好的持油能力。刘金金[9]研究发现，在蛋清中添加魔芋葡甘聚糖可以提高蛋清凝胶的硬度、耐咀性和弹性。对于常温下碱诱导蛋清凝胶的形成机理及凝胶特性的研究已经比较深入，但是用高温处理碱诱导蛋清凝胶鲜有报道。利用胶体对蛋清蛋白性质的影响，本试验将黄原胶和魔芋胶加入到鸭蛋蛋清中制备碱诱导蛋清凝胶，研究了魔芋胶和黄原胶两种亲水胶体对高温处理下碱诱导鸭蛋清凝胶液化的抑制效果及内部分子结构变化，旨在拓宽碱诱导蛋清凝胶在食品工业中的应用，为凝胶液化的抑制和控制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸭蛋：广州市天河区长湴市场；黄原胶（食品级），东方博金生物科技有限公司；魔芋胶（食品级），湖北强森魔芋科技有限公司。乙二胺四乙酸（EDTA）、5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）、尿素、溴化钾、盐酸和氢氧化钠（均为分析纯），天津市富于精细化工有限公司；β-巯基乙醇（β-Me）和8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ANS）（均为分析纯），北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

LS-35HD高压釜，江阴滨江医疗器械有限公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司；RF-5301PC荧光分光光度计，日本岛津公司；MCR301流变仪，奥地利Anton Paar公司；TA.XT plus质构仪，英国Stable Micosystem公司；Bruker Vertex 70傅立叶红外光谱，德国布鲁克（Bruker）公司。

1.3 试验方法

1.3.1 碱诱导蛋清凝胶的制备

新鲜鸭蛋用流动水清洗干净后手动分离蛋清蛋黄，用凯氏定氮法测定蛋清中蛋白质浓度并调整为10%。在蛋清中加入0.50%、1.00%、1.50%的黄原胶或魔芋胶后磁力搅拌3.5 h，加入NaOH溶液至0.45%（W/W），将制得的蛋清凝胶在高压釜中115 ℃下处理30 min，并在室温下冷却至常温。空白对照组即为只添加0.45%的NaOH溶液后制备的凝胶再进行高温处理。

1.3.2 感官评定

评价小组由 20名经过培训的食品专业研究人员组成，男女各半。参考GB/T 9694-2014《皮蛋》标准略作修改：对形态、黏弹性、颜色、透明度、滋味与气味这5项进行打分，每项指标满分为5分，最高分5分（最好），最低分1分（最差），评分按表1的评分标准进行。

1.3.3 游离碱度的测定

参照GB/T 5009.47-2003《蛋与蛋制品卫生标准的分析方法》进行测定。

表1 蛋清凝胶感官评定表Table 1 Sensory evaluation of egg white gel

1.3.4 褐变强度的测定

参考文献[11]并略做修改，称取5 g样品，加入40 mL蒸馏水，在10000 r/min下均质2 min后，在4 ℃下5000 r/min离心15 min，取上清液备用，用紫外分光光度计在294 nm和420 nm处测上清液的吸光值A294和A420，其中A294代表褐变的速率，A420代表褐变的强度

1.3.5 表面疏水性的测定

参考文献[12]并略做修改，称取1 g样品，加入19 mL的0.1 mol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液，并在10000 r/min下均质2 min，于4000 r/min离心10 min后取上清液备用。添加 20 μL 8 mmol/L的 ANS溶液至 4 mL0.05～0.50 mg/mL的蛋白溶液中，充分混匀后置于黑暗处 15 min，使用荧光分光光度计测定荧光强度（FI0），其中激发波长为390 nm，发射波长为470 nm。未添加ANS的溶液的荧光强度记为FI1。初始阶段的斜率是蛋白质分子的表面疏水性（S0），其中蛋白质浓度为横坐标，校正后的FI（FI0和FI1之差）为纵坐标。

1.3.6 游离巯基的测定

参考文献[13]的方法。

1.3.7 离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键的测定

参考文献[14]。

1.3.8 质构的测定

试验选用 P/0.5探头，具体的测试参数为：测前速度为1 mm/s，测中速度为1 mm/s，测后速度为1 mm/s，第一次下压距离为3 mm，触发力为5 g，第二次下压的距离为20 mm。

1.3.9 持水性的测定

持水性（Water holding capacity，WHC）的测定参考文献[15]并略做修改，称取约1.5 g的凝胶样品，准确记录其质量为（m1），用滤纸包裹，置于 50 mL离心管中，离心管底部放置脱脂棉，用于吸水。在4 ℃下4000 r/min离心10 min。离心后称取样品质量记为（m2），按以下公式计算持水性：

1.3.10 流变的测定

参考文献[16]并略做修改，将适量样品置于平台上，探头下压之后用石蜡密封探头防止水分流失。黏度扫描的频率范围为：0.1～100 rad/s，表观粘度为旋转速度为10 rad/s的值；频率扫描的频率范围为：1～100 Hz，应变为 1%。探头型号为：CP-50。用幂律方程G"=k′·ωn′对频率扫描的结果进行模拟[15]。

1.3.11 傅立叶红外光谱测定

取 1.5 mg真空冷冻干燥的样品粉末和 100 mg KBr在玛瑙研钵中研磨，利用粉末压片机压成片状。测定的波长范围是4000～400 cm-1，分辨率是4 cm-1；扫描次数为16次。使用PeakFit软件4.12（SeaSolve，Framigham，MA，USA）分析酰胺I带（1700～1600 cm-1）的二级结构组成。纯KBr用作空白。

1.3.12 数据分析

运用SPSS 20.0软件对试验数据进行多重比较和LSD检验，运用Origin 8.5软件对试验数据进行作图分析。所有试验均重复三次。

2 结果与讨论

2.1 表观形态、褐变强度和游离碱度的变化

图1 不同胶浓度下蛋清凝胶的表观形态Fig.1 The appearance features of egg white gel under different gum concentration

由图1可知，未添加亲水胶的蛋清凝胶在115 ℃加热 30 min之后会液化呈现溶液状，加入浓度为0.50%以上黄原胶和魔芋胶的蛋清凝胶“液化”现象得到了抑制。黄原胶的主链骨架会被侧链上的多糖链反向缠绕，形成稳定的棒状双螺旋结构，可保护主链减少被酸、碱和温度破坏[5]。魔芋葡甘露聚糖的三维立体结构呈链束状分布，在碱性条件下加热，会因脱掉分子链上的乙酰基而形成稳定的凝胶[12]。黄原胶和魔芋葡甘露聚糖的这些性质减少了其本身被碱和高温的破坏，同时其与蛋清蛋白质分子的相互作用形成的蛋白质-多糖复合物可能对碱和高温具有更好的抗性，进而可以达到抑制“液化”的目的。

不同胶浓度下蛋清凝胶的褐变强度和游离碱度的变化如表2所示。样品在294 nm处的紫外吸收可以反映美拉德反应的速率，在420 nm处的吸光度值反映褐变强度。A420值和A294值与空白相比显著增大，且均随胶浓度的增加而显著增大（p＜0.05），美拉德反应会生成棕褐色的大分子聚合物类黑精[17]，多糖含量的增加，体系的美拉德反应加快，最终生成的褐色产物增多。添加黄原胶的组别褐变程度显著低于添加魔芋胶的组别（p＜0.05），当两者的浓度为1.50%时，与空白对照组相比，黄原胶组凝胶的褐变强度提高7.99%，魔芋胶组则提高33.21%，这是因为黄原胶的双螺旋结构比较稳定，对碱和高温处理有更强的耐受力。如表2所示，空白对照组的游离碱度最大，为124.79 mg/100 g，但是随着胶浓度的增加，游离碱度显著减小（p＜0.05），可能是因为高温处理后的添加了胶体的蛋清仍保持致密的凝胶网络结构，溶于自由水中的 OH-离子填充在凝胶网络中；其次，胶浓度的增加使得美拉德反应过程中糖和Admadori化合物的降解产物中产生的有机酸就越多，在一定程度上中和了体系内的OH-[18]。当黄原胶和魔芋胶的浓度为1.50%时，游离碱度与空白组相比分别降低了32.99%和51.73%，说明黄原胶和魔芋胶与蛋白质作用后形成的凝胶结构不同，体系在高温下发生美拉德反应的程度也不同。

表2 不同胶浓度下蛋清凝胶褐变强度和游离碱度的变化Table 2 Changes of browning intensity and free alkalinity of egg white gel under different gum concentration

2.2 质构特性和持水性的变化

图2 不同胶浓度下蛋清凝胶质构特性和持水性的变化Fig.2 Changes of texture and water holding capacity of egg white gel under gum concentration

不同胶浓度下蛋清凝胶的穿刺强度、硬度和持水性如图2所示，黄原胶的浓度由0.50%增加到1.50%，穿刺强度由413.65 g增加到498 g，硬度由48.27 g增加到72.21 g，持水性由86.67%增加到87.55%，魔芋胶的浓度由 0.50%增加到 1.50%，穿刺强度由 257 g增加到459 g，硬度由25.76 g增加到56.55 g，持水性由79.29%增加到86.79%，说明两种胶的加入会显著影响凝胶的质构特性和持水性。亲水胶体的加入可以吸附体系中的自由水，同时促进了发生有序聚集前蛋清蛋白质链的展开，改变蛋白质内部的微观结构，形成更加致密有序且牢固的网络凝胶结构，经过高温处理之后，这种凝胶结构能够很好的保持。添加黄原胶的蛋清凝胶持水性能显著高于添加魔芋胶组，且表现出的质构特性更好，这可能与魔芋胶在高温和碱的作用下空间结构变化及与蛋白质的相互作用有关。

2.3 感官评价

图3 不同胶浓度对蛋清凝胶感官评分的影响Fig.3 The effect of different glue concentration on the sensory score of egg white gel

本研究选取了5项感官指标（形态、黏弹性，颜色、透明度和气味与滋味）对各个组别进行评定，满分为25分，最终的评定结果如图3所示。随着黄原胶浓度的增加，凝胶的内部会有冲孔的现象，故形态的评分减小，但魔芋胶组没有类似的现象，所以魔芋组的形态评分高于黄原胶组。当黄原胶和魔芋胶的浓度为 0.50%时，凝胶较软，黏弹性的评分最低，随着两种胶浓度的增加，凝胶的弹性和硬度增加，黏弹性的评分增加，但是高浓度的胶会加速美拉德反应的进行，褐变强度增加，进而影响凝胶的透明度和颜色，导致两项的评分均下降。气味和滋味的评分随胶浓度的增加而减小，是由于胶浓度越大，在高温下焦糖化发应程度越大，从而导致凝胶的焦糖味变重。黄原胶和魔芋胶的浓度为1.00%时，感官评分的总分最高，分别为19.5分和21分，表明在这个浓度下，凝胶的可接受度最大。

图4 不同胶浓度下蛋清凝胶的储能模量和损耗模量（a）、黏度（b）、k"和n"（c）的变化Fig.4 Changes of storage modulus and loss modulus (a),viscosity (b), k" and n" (c) of egg white gel under different glue concentrations

2.4 流变特性的变化

弹性模量反映了在一定的应变和应力下物质储藏能量的能力，代表了弹性部分；损耗模量反映物质释放机械能量的能力，代表了黏性部分[12]。由图4a可知，蛋清凝胶的储能模量和弹性模量随角频率的增加平缓增大，说明有较好的凝胶结构，所有的弹性模量均高于损耗模量，表明凝胶的弹性部分大于黏性部分。在相同的添加量下，黄原胶组的弹性模量和损耗模量均大于魔芋胶组，说明黄原胶组表现出更好的凝胶特性。黏度扫描的结果如图4b所示，凝胶的黏度随胶浓度的增加而显著增大（p＜0.05），这是因为多糖与蛋白质之间的相互作用以及多糖本身的黏度使得形成的凝胶体系表观黏度增大。k"值表示凝胶的刚性强度[19]，n"值表示凝胶系统中的共价键占比，当n"值接近0时，凝胶体系中共价键占比较高，当值接近1时表示形成的凝胶是物理凝胶[20]。如图4c所示，加入黄原胶和魔芋胶的蛋清凝胶k"显著增加（p＜0.05），这与质构特性的变化一致，n"减小明显（p＜0.05），说明加胶能增加凝胶体系中的共价键占比。其中魔芋胶在添加量少于 1.00%时，n"值显著高于空白组和黄原胶组（p＜0.05），这与黄原胶和魔芋胶结构以及与蛋白质相互作用相关。

2.5 表面疏水性和游离巯基的变化

图5 不同食用胶浓度下蛋清凝胶表面疏水性和游离巯基的变化Fig.5 Changes of surface hydrophobicity and free sulfhydryl groups of egg white gel under edible gum concentration

蛋白质的表面疏水性反映了蛋白质分子表面的疏水性氨基酸的相对含量，是蛋白质的重要特性之一[21]。如图5所示，与空白组相比，加入黄原胶和魔芋胶之后，凝胶的表面疏水性均显著降低（p＜0.05），这是因为两种胶的亲水性使得暴露在分子表面的疏水基团减少，同时疏水基团会被包埋于凝胶网络结构中，凝胶的结构越稳定，游离的疏水基团就越少。美拉德反应产物中也可能会产生一些亲水性的物质，从而导致表面疏水性降低。加入黄原胶的蛋清凝胶表面疏水性显著大于魔芋胶组的表面疏水性（p＜0.05），是因为黄原胶作为阴离子胶，其本身也具有一定的疏水性，与蛋白质作用后有利于蛋白质内部疏水基团的暴露[7]。除黄原胶的浓度为 1.50%外，其他各组的蛋清凝胶的游离巯基含量显著高于空白组（p＜0.05），是因为蛋清蛋白与亲水胶相互作用使蛋白质的构象发生变化，分子结构展开，分子内部包埋的巯基不断暴露出来[21]。加入亲水胶体之后，随着胶浓度的增加，黄原胶组的游离巯基下降 51.27%，魔芋胶组则下降15.00%，这可能是因为蛋白质与亲水胶的相互作用增强，在高温下，促进了巯基与二硫键的交换反应生成更多的二硫键，最终形成了较好的凝胶结构。

2.6 分子间作用力的变化

图6 不同胶浓度下蛋清凝胶化学作用力的变化Fig.6 The changes of intermolecular interaction of egg white gel under edible gum concentration

从图6可知，随着胶浓度的增加，黄原胶组的S1占比显著降低（p＜0.05），而魔芋胶组的S1占比显著增加（p＜0.05），但均显著低于空白对照组（p＜0.05）。胶的加入能吸附蛋清溶胶体系中的自由水，减弱蛋白质与水分子离子基团之间的静电排斥，导致离子相互作用减少[22]，而添加黄原胶组与魔芋胶组的变化差异可能来自于二者结构的不同。在胶的浓度大于 0.50%时，S2和S4占比显著大于空白组（p＜0.05），且均随胶浓度的增大显著升高（p＜0.05），说明氢键和二硫键能显著影响蛋清凝胶特性。氢键是黄原胶和魔芋胶分子间的主要作用力，故胶浓度的增加会导致体系氢键含量的增加，同时胶浓度的增加会使得游离巯基的含量减少，导致二硫键的含量增加。有研究表明疏水相互作用和二硫键是热诱导蛋清蛋白凝胶中的主要分子间作用力[23]，这与我们的研究结果一致。加胶组的S3占比显著大于空白组（p＜0.05），而黄原胶组无显著差异（p＞0.05），魔芋胶组的S3占比显著减少（p＜0.05）。蛋白质分子内部的亲水性基团与多糖发生亲水性结合，暴露于表面的疏水基团之间发生疏水相互作用以维持整个凝胶体系的稳定，故加亲水胶组的表面疏水性显著大于空白组。

2.7 蛋白质二级结构的变化

分析酰胺I带（1600～1700 cm-1）可以得到蛋白质的二级结构信息[24]。由表2可知，随着黄原胶浓度的增加，无规则卷曲比例减少显著（p＜0.05），而α-螺旋的比例增加显著（p＜0.05），β-折叠和T-转角的比例无显著变化（p＞0.05），这可能是在蛋白和多糖的相互作用下，蛋白质分子形成了更加有序的结构；随着魔芋胶比例的增加，β-折叠比例减小显著（p＜0.05），无规则卷曲和α-螺旋比例增加显著（p＜0.05），T-转角在魔芋胶添加量为1.00%时取得最大值，为40.54%。两种加胶组的二级结构占比与变化存在显著差异，黄原胶的浓度由 0.50%增加到 1.50%，无规则卷曲减少了41.23%，α-螺旋增加了81.29%，但是魔芋胶由0.50%增加到1.50%，β-折叠减少了34.97%，无规则卷曲和α-螺旋分别增加了 68.97%和 70.37%，说明黄原胶与魔芋胶对蛋清蛋白质二级结构的影响机制不同。与空白组的二级结构变化相比，添加亲水胶明显改变了蛋白质的二级结构，这也许是抑制碱诱导鸭蛋清凝胶高温液化的原因之一。

表3 不同食用胶浓度下蛋清凝胶蛋白二级结构的变化Table 3 Changes of the secondary structure of egg white gel protein under different edible gum concentration

3 结论

本试验研究了黄原胶和魔芋胶对碱诱导鸭蛋蛋清在高温处理下液化的抑制作用。研究结果表明，两种胶体的加入均能抑制碱诱导鸭蛋蛋清在高温下的液化，且赋予碱诱导蛋清凝胶更好的质构特性和流变特性，添加黄原胶所形成的凝胶质构特性和持水性优于魔芋胶，但魔芋胶对于凝胶褐变强度和黏度的影响大于黄原胶，当黄原胶和魔芋胶的浓度均为 1.00%时，凝胶的感官评分最高；添加黄原胶和魔芋胶改变了凝胶分子间作用力，主要表现在氢键和二硫键作用的增强；当黄原胶和魔芋胶的浓度增加到1.50%时，与对照组相比，表面疏水性分别降低了71.80%和76.44%，游离碱度分别降低了32.99%和51.73%。黄原胶和魔芋胶对蛋白质二级结构影响存在差异，其中黄原胶浓度的增加，减少了无规则卷曲占比，增加了α-螺旋占比，但魔芋胶浓度的增加，降低了β-折叠占比，增加了无规则卷曲和α-螺旋占比，因此两种亲水胶的加入改变了蛋清蛋白的二级结构和凝胶分子间的相互作用力，从而达到抑制液化的目的，但是由于两种胶体的结构和性质存在差异，导致形成的凝胶在质构、持水性、流变和褐变强度等方面有所不同。本试验对添加食用胶抑制高温处理碱诱导凝胶“液化”的机理进行了初步的讨论，认为黄原胶和魔芋胶的浓度为 1.00%更适合于工业生产，这对于拓宽碱诱导蛋清凝胶在食品工业中的应用具有重要意义，但其中更深入、更复杂的变化还有待于进一步研究。