时间分辨荧光免疫层析法定量检测谷物中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留

王序，卢迪莎，曾道平，黄健欣，吴颖，许小炫，谭庶，杨金易

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.温氏食品集团股份有限公司，广东云浮 527499）

真菌毒素是真菌在生长过程中产生的次级代谢产物[1]，广泛存在于粮食作物中，如玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱等[2]。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素 B1（AflatoxinB1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、T-2 毒素（T-2toxin，T-2）、伏马毒素（Fumonisin，FB）和赭曲霉毒素 A（Ochratoxin，OTA）等[3]。AFB1和ZEN往往在粮食产品贮存时由真菌产生，有强烈的致癌性、生殖毒性、免疫毒性和细胞毒性，引发人和动物慢性甚至急性中毒[4]。根据粮农组织的统计，每年全球25%的农产品被真菌毒素污染，造成数千亿美元的经济损失[5]。由于大多数真菌能产生多种真菌毒素，故农产品和食品通常会受到多种真菌毒素的污染，因此真菌毒素对农产品和食品的污染往往是混合污染[6]。我国是黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮污染较严重的国家之一，在玉米、小麦及其谷物产品中污染现象严重[7]。为保障消费者健康不受到损害，我国将谷物及其加工产品中的黄曲霉毒素B1的限量定为5 μg/kg，玉米赤霉烯酮限量为 60 μg/kg[8,9]。

目前，针对检测农产品和食品中AFB1和ZEN两种真菌毒素的研究已有大量报道，主要有高效液相色谱-质谱法联用，高效液相色谱气相色谱法等色谱法[10,11]。虽然色谱及其联用技术能检测灵敏度高、重复性好，能够实现农产品和食品当中真菌毒素的准确分析，但是仪器分析需要专业技术人员的培训，复杂的样品前处理步骤以及昂贵的仪器设备，无法满足现场快速检测的需要[12]。免疫分析法的基本原理是抗原抗体的特异性结合反应[13]。当前免疫分析法中应用最广泛的是酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）和胶体金免疫层析法（Gold Immuno chromatography Assay，GICA）[14]。ELISA指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法[15]。ELISA灵敏度高、特异性强、重复性好，但需要借助光学仪器判读结果、抗原抗体孵育时间较长、操作步骤繁琐，限制了其在现场快速检测的应用[16]。胶体金免疫层析法（GICA）以胶体金作为示踪物，玻璃纤维上的胶体金与药物结合，通过层析作用，金标复合物聚集在检测线上，可通过颜色的深浅进行肉眼定性或检测光信号进行定量检测。GICA广泛应用在激素检测、病毒检测、真菌毒素残留物检测和兽药残留检测[17]。但是，由于胶体金颗粒不具有自发光性能，所以需要大量颗粒聚集才能达到可视化水平，从而使GICA在定量检测中无法达到ELISA高灵敏度的检测水平[18]。随着技术的进步，新型检测技术逐渐被开发出来，基于稀土金属时间分辨特征的荧光免疫层析分析技术，以其高灵敏、抗干扰、检测方便、逐渐成为市场备受青睐的产品。

时间分辨荧光免疫层析技术（Time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，TRFIA）是以包埋了镧系元素离子螯合物的微球为标记物[19]，利用化学键或物理作用使标记物与生物活性物质结合，通过竞争反应体系，根据荧光强度与相对荧光强度的比值，通过计算来对分析物进行定性和定量分析，起到定性或定量的作用[20]。镧系元素离子螯合物的荧光衰变时间长，是一般荧光物质的 103～106倍，故在利用镧系元素作为示踪物的技术中，通过延迟检测时间，等待样品中存在的荧光物质或者荧光背景完全猝灭后再采集镧系元素的特异性荧光信号，极大程度减少了背景干扰，使数据更为准确[21]。目前已建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法多集中于对单个真菌毒素进行分析，针对多种真菌毒素的时间分辨荧光免疫层析检测方法鲜有报道。本研究基于实验室前期制备的黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮半抗原和黄曲霉毒素B1单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体，以市场上常见易得的谷物产品玉米、麦麸、大豆、小麦为样品，优化了免疫层析检测条件，建立了用于黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮快速检测的时间分辨荧光免疫层析方法，借助荧光免疫层析读数仪实现对样品中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的定量分析。为进一步研制适用于现场谷物样品中黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮快速检测产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

硝酸纤维素膜（NC膜）、样品垫、PVC底板、吸水垫、时间分辨荧光微球TRFMs（200 nm，固含量1%），上海杰一生物科技有限公司；样品垫处理液和荧光探针复溶液，温氏食品集团股份有限公司；FAPAS样品，中检维康公司；黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮包被原及其单克隆抗体均为实验室前期制备所得，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、吐温-20（Tween-20）、蔗糖（C12H22O11）国药集团化学试剂有限公司；黄曲霉毒素B1（AFB1，≥98%）、玉米赤霉烯酮（ZEN，≥98%）、T-2毒素（T-2，≥98%）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，≥98%）、伏马毒素（FB1，≥98%）、赭曲霉毒素（OTA，≥98%）、羊抗鼠IgG（HRP标记）、N,N-二甲基亚酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC），美国Sigma公司；玉米、麦麸、大豆、小麦样品，温氏食品集团股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

KQ-100E超声波清洗器、CTS300数控裁条机，上海金标生物科技有限公司、XYZ3060划膜仪，美国 BioDot公司；荧光免疫层析读数仪，广州敏捷生物科技有限公司；MultiskanMK3、高速落地离心机（Lynx4000）酶标仪，美国Thermo公司；恒温磁力搅拌器（B11-2型），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；纯水仪（UNIQUE-R10），广州誉维生物科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光探针与荧光免疫层析试纸条的制备

用1 mol/L的HCl溶液条件0.01 mol/mL MES缓冲液至一定pH值，加入10 µL荧光微球，100 μL（0.5 mg/mL）的EDC和100 μL（0.5 mg/mL）的NHS，超声混匀 2 min，使用恒温培养摇床振荡活化反应 15 min，随后离心20 min，转速为14000 r/min。弃掉上清液，复溶于1 mL 0.02 mg/mL BB缓冲液中；加入抗体，放置恒温培养摇床振荡反应30 min；随后加入200 μL 10%（W/V）BSA溶液，放置恒温培养摇床振荡，封闭60 min。4 ℃、14000 r/min离心20 min，弃去上清液，用荧光微球复溶液复溶（0.01 mol/L PBS、3%海藻糖、3%蔗糖、1% BSA、0.4% Tween-20）至200 μL，超声使其悬浮，备用。

用XYZ3060划膜仪在NC膜上喷涂一定浓度的AFB1-OVA、ZEN-OVA（0.8 μL/cm）和羊抗鼠二抗（1 mg/mL，0.8 μL/cm），分别做为检测线（T1线、T2线）和质控线（C线），线与线之间保持3 mm距离，将NC膜置于37 ℃的烘箱中干燥12 h。样品垫经过样品垫处理液（0.01 mol/L PBS、0.5% BSA、0.5%Tween-20）浸泡后，置于37 ℃的烘箱烘干12 h，使用数控裁条机（CTS300）将其裁切成38 mm宽。将吸水纸裁切成24 mm宽；最后将NC膜贴在PVC底板中部，吸水纸和样品垫分别组装在 PVC底板上下两端，并与NC膜形成2 mm的重叠；最后将组装好的试纸条通过微电脑自动斩切机（ZQ2000）切成 4.5 mm宽的试纸条，密封干燥保存备用。

1.2.2 免疫层析试纸条的检测步骤

100 μL 0.02 mol/L PB缓冲液或样品提取液加入荧光探针微孔中吹打混匀，孵育3 min后，将试纸条插入微孔中反应 5 min。通过读数仪测定，建立标准曲线，对样品中黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮含量进行测定。采用荧光免疫层析读数仪分别读取 T1，T2线和 C线的荧光信号值，计算抑制率。B0为阴性样本的T/C值，B为阳性样本的T/C值。

图1 荧光免疫层析试纸条检测原理图Fig.1 Schematic diagram of lateral

1.2.3 荧光免疫层析试纸条的单因素实验

1.2.3.1 标记pH的选择

将0.01 mol/mL MES缓冲液pH值分别调至7.0、6.0、5.0、4.0，在此条件下偶联抗体，根据微球荧光强度确定活化pH值。

1.2.3.2 标记抗体用量的选择

确定荧光微球活化pH值后，参照所用微球建议蛋白包被量范围，对AFB1单克隆抗体（AFB1-mAb）用量进行优化，分别取 1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 μg进行标记反应2 h，反应后离心14000 r/min离心20 min，取上清液通过超微量核酸蛋白测定仪检测蛋白质浓度，按公式计算偶联率。ZEN单克隆抗体用量按同样方法测得偶联率，将 ZEN单克隆抗体（ZEN-mAb）用量稀释为1.8、3.6、5.4、7.2、9、18 μg进行实验。

1.2.3.3 荧光探针的用量的选择

取适量体积的荧光探针在微孔中与待测药物反应，过量的标记抗体会使吸光值偏大，造成灵敏度降低，取不同体积的荧光探针，分别测定 AFB1荧光探针和ZEN荧光探针分别在AFB1（10 ng/mL）与ZEN（100 ng/mL）的抑制率做判定指标，根据试纸条的抑制率和用量确定荧光探针的用量。

1.2.3.4 检测线上的包被原用量的选择

在已确定的抗体标记 pH值和浓度条件下，用0.02 mol/mL PB缓冲液作为检测线划膜稀释液将AFB1-OVA 稀释 2、1、0.5、0.25 mg/mL，将ZEN-OVA包被原稀释1.8、0.9、0.45、0.225 mg/mL分别喷涂于NC膜的T1、T2线上，羊抗鼠IgG以0.60 mg/mL喷涂NC膜的C线，放入37 ℃烘箱中烘12 h，制备组装成试纸条。按 1.2.2步骤，使用药物入AFB1标准品（150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0 ng/mL），ZEN 标准品（1500、1000、500、200、100、50、20、10、5、0 ng/mL）进行测试。再以待测药物浓度为x轴，以B/B0为y轴（B0为不添加药物时的T/C值，B为x浓度药物时的T/C值），通过 Origin9.0绘图软件建立待测药物的标准曲线，并确定分析方法的检测范围。根据半抑制浓度（IC50），包被原用量较少的组合确定最佳条件。

1.2.3.5 质控线上的羊抗鼠IgG用量的选择

在已确定的抗体标记pH值和浓度条件下，将最佳浓度的AFB1-OVA、ZEN-OVA包被原喷涂于NC膜的 T1、T2线上，羊抗鼠 IgG以 0.80、0.60、0.40、0.20 mg/mL喷涂NC膜的C线，37 ℃包被过夜。按1.2.2步骤，使用药物入 AFB1标准品（150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0 ng/mL），ZEN 标准品（1500、1000、500、200、100、50、20、10、5、0 ng/mL）进行测试。再以待测药物浓度为x轴，以B/B0为y轴（B0为不添加药物时的T/C值，B为x浓度药物时的T/C值），通过Origin 9.0绘图软件建立待测药物的标准曲线，并确定分析方法的检测范围。根据半抑制浓度（IC50），包被原用量较少的组合确定最佳条件。

1.2.4 样品前处理优化

本实验所有样品，均由温氏食品集团股份有限公司提供，取玉米粉碎，过20目，待用。

1.2.4.1 提取剂的优化

对比乙酸乙酯、乙腈和甲醇提取效果。准确称取1.0 g玉米粉样品，向离心管中加入5 mL提取剂，漩涡振荡5 min，4000 r/mim离心2 min；取上清液100 μL于离心管中，再加入400 μL 0.2 mol/mL PB（pH 7.4）混匀备用，取100 μL试样滴加与试纸条样品垫上。

1.2.4.2 提取时间的优化

准确称取1.0 g玉米粉样品，向离心管中加入5 mL提取剂，分别漩涡振荡3 min，5 min和7 min。4000 r/min离心 2 min；取上清液 100 μL于离心管中，再加入400 μL 0.2 mol/mL PB（pH 7.4）混匀备用，取100 μL试样滴加与试纸条样品垫上。

1.2.5 检测方法的评价

1.2.5.1 灵敏度评价

选取经HPLC-MS/MS确证未被AFB1及ZEN污染的玉米粉的提取液（提取方法同2.1.3.5）加入AFB1标准品（150、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0 ng/mL），ZEN 标准品（1500、1000、500、200、100、50、20、10、5、0 ng/mL），每个浓度梯度进行三组平行试验，灵敏度通过阴性样本的平均值减去三倍标准差之和，公式如下：

1.2.5.2 特异性评价

用交叉反应率（Cross-reactivity，CR）来评价抗体的特异性。采用时间分辨荧光免疫层析检测方法测定对黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN），T-2毒素（T-2）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、伏马毒素（FB1）、赭曲霉毒素 A（OTA）各竞争物的半抑制浓度（Halfofinhibitionconcentration，IC50），计算交叉反应率对方法的特异性进行评价。

1.2.5.3 准确度

本实验采用经HPLC-MS/MS测定出AFB1，ZEN含量的 FAPAS样品进行前处理，用建立的荧光微球免疫层析方法进行检测，计算符合率（Coincidencerate）和变异系数（Coefficient of variation，CV），以评价该方法的准确度。

1.2.5.4 添加回收

选取经HPLC-MS/MS确证未被AFB1和ZEN污染的12份谷物样品，分别添加3种药物标准品，每种药物各添加3个在检测线性范围内的不同浓度，采用本荧光免疫层析方法检测加标样品，按公式2.5计算回收率。

1.2.5.5 与胶体金免疫层析法（GICA）的比较

选取 12份不同的玉米粉样品，分别采用本时间分辨荧光免疫层析方法及GICA进行检测，比较两种方法检测结果。

1.2.5.6 与酶联免疫吸附法（ELISA）的比较

选取经HPLC-MS/MS确证未被AFB1和ZEN污染的 20份玉米样品分别添加两种药物，分别采用本时间分辨荧光免疫层析方法及 ELISA分析方法进行检测，以层析法检测浓度为x轴，ELISA试剂盒检测浓度为y轴，以线性回归法分析两种方法的检测值，比较两者的相关性。

2 结果与讨论

2.1 时间分辨荧光微球的鉴定

通过扫描电子显微镜观察时间分辨荧光微球的超细微结构（图2），根据图例目测微球的直径为200 nm，可见其大小分布均匀，结构完整，为均一的单分散性球形粒子，这样的粒子保证了标记过程中抗体在其表面的均匀且牢固结合。因此，该时间分辨荧光微球可用于后续多残留时间分辨荧光微球免疫层析试纸条的研制。

图2 时间分辨荧光微球的扫描电子显微镜扫描图Fig.2 SEM images of Fluorescent microspheres labeled

2.2 免疫层析试纸条的优化

2.2.1 最适pH的选择

图3 不同pH活化的荧光微球Fig.3 Fluorescent microspheres labeled with different pH

活化采用的碳化二亚胺法中EDC在酸性条件下反应形成酰胺键的水溶液，所以偶联反应当在酸性条件下发生，但酸性过高会导致 EDC自我聚沉从而影响活化效率。如图3当活化pH值5.0时，荧光微球显色强度最佳，能获得理想的活化水平。

2.2.2 标记抗体用量的选择

荧光微球标记蛋白的量有一定的范围，当荧光微球表面的活化羧基与蛋白发生最大限度地偶联时，过量未偶联的蛋白将在离心时与荧光微球分离，随上清液弃去。因此，确定最大抗体标记量，有利于减少原料浪费。微球偶联效率先快速增加，偶联率约达90%，加入的抗体基本被标记上；随后微球实际标记抗体量增长趋向稳定，当加入的 AFB1-mAb、ZEN-mAb超过微球可标记最大抗体量时，偶联效率逐渐降低，过多的未偶连上的抗体随离心上清液除去。如表1和图4所示，4.8 μg AFB1-mAb，5.4 μg ZEN-mAb为最佳抗体标记量。

图4 (a)加入AFB1-mAb抗体量的实际标记量与偶联率；(b)ZEN-mAb加入不同抗体量的实际标记量与偶联率Fig.4 (a) The actual label amount and coupling rate of the amount of AFB1-mAb antibody added (n=3); (b) The actual labela mount and coupling rate of the amount of ZEN-mAb antibody added (n=3)

表1 加入不同抗体量的实际标记量与偶联率Table 1 The actual label amount and coupling rate of different antibody amounts added (n=3)

2.2.3 荧光探针的用量选择

图5 不同探针用量对抑制率的影响Fig.5 The influence of different probe dosage on the inhibition rate

在确定最佳活化pH值和最佳抗体用量组合后，对荧光探针的使用量进行优化。AFB1与ZEN荧光探针用量分别为1、2、3、4、5、6 μL，在微孔中分别加入100 μL AFB1浓度为10 ng/mL的标准品和ZEN浓度为100 ng/mL标准品进行试纸条测试，计算各自的抑制率并选择最优荧光探针用量。如图5所示，综合对比后，选择4 μL为AFB1的荧光探针最佳用量；3 μL为ZEN的荧光探针最佳用量。

2.2.4 检测线上的包被原的用量选择

将AFB1-OVA（5 mg/mL）用0.02 mol/mL PB梯度稀释 2、1、0.5、0.25 mg/mL划在 T1线上，ZEN-OVA（4.5 mg/mL）用0.02 mol/mL PB梯度稀释1.8、0.9、0.45、0.225 mg/mL划T2线上。使用荧光读数仪采集试纸条在AFB1标准品（150、100、50、20、10、1.0、0 ng/mL），ZEN 标准品（1500、100、500、200、100、50、0 ng/mL）的T/C值，再以待测药物浓度为x轴，以B/B0为y轴（B0为不添加药物时的T/C值，B为x浓度药物时的T/C值），通过Origin 9.0绘图软件建立待测药物的标准曲线。如图6所示：建立的标准曲线 IC50最低分别为 2.33 ng/mL，23.43 ng/mL，所以。选择T1包被原浓度为0.5 mg/mL，T2包被原浓度为0.9 mg/mL。

图6 (a)不同T1包被原浓度对AFB1灵敏度影响；(b)不同T2包被原浓度对ZEN灵敏度影响Fig.6 (a) Dosage optimization of the T1 coating antigen for AFB1 (n=3); (b) Dosage optimization of the T2 coating antigen for ZEN (n=3)

图7 羊抗鼠IgG用量对灵敏度的影响Fig.7 The influence of different probe dosage on the inhibition rate

2.2.5 质控线上的羊抗鼠IgG的用量选择

在最佳T1、T2线检测浓度下，对C线检测浓度进行优化，随着羊抗鼠IgG浓度的增大，使用读数仪测定T1、T2线标准曲线，发现IC50先下降后上升，如图7所示：选择0.6 mg/mL为C线划线浓度。

2.3 样品前处理优化

图8 与ELISA法比较线性方程Fig.8 Linear equation compared with ELISA method (n=3)

使用甲醇、乙酸乙酯和乙腈提取样品。对比三种有机溶剂，乙酸乙酯乙腈提取的阴性谷物样品样品液基质干扰较大，T线显色较浅，且加标的样品提取率均低于30%（图8a），甲醇提取效果较好，基质干扰小。试纸条检测显示阴性样品T线和C线显色明显，玉米粉样品添加回收率高于75%。

使用甲醇提取溶剂，分别对比振荡3 min、5 min和7 min时加标玉米粉样品提取效果，由图8b可知，振荡3 min样品回收率为60%左右，当提取时间为5 min以上时回收率可达85%。提取时间延长样品添加回收率偏差较小。为保证黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮的提取效果且控制处理时间适用于快速检测的特点，确定样品提取时间为5 min。

2.4 时间分辨荧光免疫层析检测方法的性能评价

2.4.1 灵敏度评价

图9 (a)AFB1标准曲线；(b)ZEN标准曲线；(c)AFB1标准曲线实物图；(d)ZEN标准曲线实物图Fig.9 (a) AFB1 standard curve (n=3); (b) ZEN standard curve(n=3); (c) AFB1 standard curve physicalmap; (d) ZEN standard curve physicalmap

在优化条件下进行检测，使用荧光读数仪采集试纸条在 AFB1标准品（150、100、50、20、10、1.0、0 ng/mL），ZEN 标准品（1500、100、500、200、100、50、0 ng/mL）的T/C值，再以待测药物浓度为x轴，以B/B0为y轴（B0为不添加药物时的T/C值，B为x浓度药物时的T/C值），通过Origin 9.0绘图软件建立待测药物的标准曲线。所得方法在 AFB1的检出限为 0.80 ng/mL，线性范围（IC20～IC80）为 0.81～5.67 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为2.15 ng/mL，R2=0.99。在ZEN检出限为4.58 ng/mL，线性范围（IC20～IC80）为 4.76～85.60 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为 20.19 ng/mL，R2=0.99。

2.4.2 特异性评价

表2 特异性评价Table 2 Evaluation of specificity (n=3)

免疫检测中的特异性指抗原与由它刺激所产生的抗体结合的专一性，可用交叉反应率表示。本研究分别取AFB1、ZEN两种种药物的几种常见类似物进行检测，计算交叉反应率（CR），检测结果如表2所示。黄曲霉毒素B1与玉米赤霉烯酮、T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1、赭曲霉毒素 A之间交叉反应率均＜0.1；玉米赤霉烯酮与常见类似物黄曲霉毒素B1、T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A之间交叉反应率均＜0.1。以上结果说明，本时间分辨荧光免疫层析检测方法对AFB1、ZEN的检测有较好的特异性。

2.4.3 准确度评价

准确度是指检测值与真实值的接近程度，用以衡量分析方法的正确性，可用回收率表示。本研究选取20份经HPLC-MS/MS检测过的FAPAS标准质控样本进行测试，由表3可知，本荧光试纸条测量 FAPAS样品中的AFB1时批内平均回收率为99.0%，变异系数在 6.3%；批间平均回收率为 99.1%，变异系数在11.6%之间；ZEN批内平均回收率为100.7%，变异系数在10.3%；批间平均回收率为102.1%，变异系数在10.6%之间。

2.4.4 添加回收

选取经过HPLC-MS/MS确证未被AFB1及ZEN污染的玉米，小麦，麸皮，大豆，蛋白粉，进行添加回收实验。结果显示如表4：AFB1的添加回收率在97.1%～108.7%，ZEN 的添加回收率在 92.8%～109.1%，变异系数小于 15%，添加回收率和变异系数均满足存留检测的需求。

2.4.5 与其他快速检测方法的检测比较

2.4.5.1 与胶体金免疫层析卡（GICA）比较

采用本时间分辨荧光免疫层析检测方法及市售胶体金免疫层析卡（GICA）检测不同的谷物样品，检测结果如表5所示，两种方法检测出的阴、阳性结果相当，符合率为 100%，证明本本时间分辨荧光免疫层析检测方法具有良好的准确性。

2.4.5.2 与酶联免疫吸附法（ELISA）比较

图10 与ELISA法比较线性方程Fig.10 Line are quation compared with ELISA method (n=3)

采用时间分辨荧光免疫层析检测方法及市售ELISA试剂盒分别检测添加不同的谷物样品，相关性可用线性回归分析中的相关系数（R2）表示。将本时间分辨荧光免疫层析检测方法及 ELISA法检测结果进行线性拟合，结果如图10所示。

表3 FAPAS中AFB1、ZEN的回收率和变异系数Table 3 Recovery rate and coefficient of variation of AFB1 and ZEN in FAPAS (n=5)

表4 样品添加回收实验Table 4 Recoveries of AFB1 and ZEN by TRFIA (n=3)

表5 时间分辨荧光免疫层析检测方法与GICA检测比较Table 5 Comparison of time-resolved fluorescence immunochromatographic dual detection method and GICA detection (n=3)

3 结论

本实验本研究基于荧光读数仪，建立了快速定量测定谷物产品中黄曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光免疫层析方法，主要结论如下：通过对了如pH值、标记抗体浓度、荧光探针使用量、检测T线包被原浓度、质控C线羊抗鼠IgG浓度、样品前处理方法等因素的优化获得最佳工作条件；谷物中AFB1/ZEN的 LOD为 0.80/4.58 ng/mL，IC50为2.15/20.19 ng/mL，检测范围在 0.81～5.67 ng/mL/4.76～85.60 ng/mL之间，谷物样品使用甲醇振荡提取，样品添加平均回收率在 92.8%～109.1%之间，变异系数相对标准偏差小于15%，与其他真菌毒素交叉反应率小于1%。通过与FAPAS标准质控品、市售胶体金免疫试纸条和 ELISA试剂盒检测对比，检测结果与 UPLC-MS/MS及其市售检测产品具有较好的相关性。本方法操作简单快速、可定量，可通过紫外灯定性或半定量快速检测谷物样品中两种真菌毒素，同时也可以结合荧光读数仪进行现场定量检测，有效提高了检测灵敏度，实现谷物样品中真菌毒素的痕量分析。