暗褐网柄牛肝菌的分子鉴定及母种培养基筛选

张冰冰，张国珍，樊莉娟，王 菲，秦小波，，徐 莺

（1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2.四川省自然资源科学研究院，成都610015）

暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）隶属于牛肝菌目（Boletales）小牛肝菌科（Boletaceae）网柄牛肝菌属（Phlebopus），主要分布于热带地区，中国主要分布在四川、云南、广西、海南等地［1］。牛肝菌目食用菌营养丰富，风味独特，深受消费者喜爱，市场消费前景好［2］。但是，目前实现人工栽培的牛肝菌目种类还只有暗褐网柄牛肝菌，其栽培模式是利用组织分离法［3］从子实体上获得母种菌丝，进而繁育出原种、栽培种，最终获得商业化子实体。因此，优质母种菌丝是获得优质子实体的基础。研究表明母种菌丝的长势会随着继代次数的增加而减弱，需要适合的母种培养基予以维持［4⁃5］。本研究在对收集的暗褐网柄牛肝菌进行分子鉴定的基础上，对分离出的菌丝生长所需的氮源、氮源浓度、无机盐和维生素B1 进行了优化探究，以期为暗褐网柄牛肝菌的人工栽培技术的发展提供实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

野生牛肝菌样品采集于中国西南地区，通过组织分离法获得纯化菌株。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

参照张春霞等［6］的描述对其进行形态学鉴定。

1.2.2 基于rDNA ITS序列分析的分子鉴定

采用DNA 提取试剂盒（天根生化北京有限公司）进行提取子实体DNA 为模板，利用rDNA ITS 通用引物ITS1（5'⁃TCCGTAGGTGAACCTGCGG⁃3'）与ITS4（5'⁃TCCTCCGCTTATTGATATGC⁃3'）（上海生工生物工程技术服务有限公司）进行PCR 扩增。PCR 扩增反应使用2×TSING Master Mix体系（擎科生物技术有限公司），在BIO⁃RAD T100TM Thermal Cycler PCR 仪上进行。PCR反应参数：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，34 个循环；72 ℃再延伸10 min，12 ℃保存。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带连接至T4 Quick Blunt 载体，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序后，采用BLAST 工具在NCBI 核酸数据库中进行同源性比较分析。

1.2.3 氮源筛选

以PDA 培养基为基础培养基［6］，分别加入2 g/L酵母膏、2 g/L 牛肉膏、0.5 g/L NH4Cl、0.5 g/L NH4NO3进行氮源筛选。用6 mm 打孔器取菌块接种于供试培养基中央，每皿1 块，25 ℃恒温箱暗培养14 d，十字交叉法测量菌落直径。每个处理3个重复。

1.2.4 氮源浓度的优化

对筛选出的最适氮源分别取0.5、1.0和1.5 g/L等3个质量浓度进行优化筛选，培养条件和菌落直径测量方法同上。

1.2.5 维生素B1对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响

在含不同氮源（2.0 g/L 酵母膏、2.0 g/L 牛肉膏、0.5 g/L NH4Cl、30.5 g/L NH4NO3）的基础培养基中，设置空白对照组与0.05 g/L 维生素B1组，进行对菌丝培养效果比较，重复3 次，培养条件和菌落直径测量方法同上。

1.2.6 无机盐筛选

在基础培养基中加入1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4作为对照，用1.0 g/L MgCl2、1.0 g/L KCl 代替对照培养基的MgSO4／KH2PO4作为处理组，每个处理3个重复，培养条件和菌落直径测量方法同上。

1.3 数据分析

数据统计用SPASS 22.0软件采用ANOVA 方法完成。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

供试样品呈担子果肉质，菌盖直径6.75～8.44 cm，表面平滑，无光泽、无黏液，中凹，黑褐色；菌肉有微酸味，松软，海绵质，淡黄色；菌管髓菌丝平行列，孔口圆形；菌柄长6.44～8.46 cm，直径3.0～4.5 cm，中生，近柱形，暗褐色，表面具网纹，基部膨大。在显微镜下观察孢子，呈深黄色，短椭圆形，担子呈长棒状（图1）。观察发现，供试样品无论子实体形态还是孢子特征均符合胡生华等［5］对网柄牛肝菌属的记载，初步鉴定样品隶属于网柄牛肝菌属。

图1 供试牛肝菌样品的形态学鉴定Figure 1 Morphological identification of boletus samples

2.2 基于ITS序列的分子鉴定

使用真菌通用引物ITS1 和ITS4 对供试牛肝菌样品的ITS 序列进行PCR 扩增，获得长度为750～1 000 bp的扩增产物（图2）。经克隆测序后发现，供试牛肝菌子实体样品的rDNA ITS 序列分为两个长度：790 bp 和793 bp（表1）。将所获序列与GenBank 核酸序列数据库进行序列相似性检索，皆与GenBank 中暗褐网柄牛肝菌ITS 序列（JQ695905.1）相似性程度达到99%，说明所获样品均属于暗褐网柄牛肝菌。

图2 各样品rDNA ITS区段PCR产物电泳结果Figure 2 Phlebopus portentosus rDNA ITS amplification patterns

表1 ITS序列比对及种属鉴定Table 1 ITS sequence alignment and species identification

2.3 菌丝体培养条件的优化

2.3.1 氮源的筛选

氮源是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料，对菌丝的生长发育至关重要。暗褐网柄牛肝菌菌丝在供试的4 种氮源培养基中生长差异较大（图3）。从菌落直径来看，从大到小依次为：氯化铵培养基、牛肉膏培养基、硝酸铵培养基和酵母膏培养基。前两者显著大于酵母膏培养基，并且两者之间的差异也达到显著水平，但硝酸铵和酵母膏的差异未达到显著水平；从菌落形态来看，酵母膏和牛肉膏培养基菌落颜色呈灰褐色，略深于氯化铵和硝酸铵培养基菌落的黄褐色；酵母膏和牛肉膏培养基的菌丝也较氯化铵和硝酸铵培养基菌丝粗壮；酵母膏培养基和硝酸铵培养基的菌落直径较为整齐，牛肉膏培养基和氯化铵培养基次之。

图3 不同氮源对菌丝生长的影响Figure 3 Effect of different nitrogen sources on the growth of mycelium

2.3.2 氮源浓度的优化

氯化铵的浓度对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长也有明显影响，但主要体现在菌丝形态上（图4）。在不同浓度处理下的菌落直径差异均未达到极显著差异，仅含1.5 g/L 氯化铵的培养基上的菌落直径与前两者相比有显著性下降，但减少幅度也仅为3%～5%（图4）。但是，在形态方面，含0.5 g/L 氯化铵的培养基上生长的菌丝颜色最深，呈暗褐色，菌丝最为粗壮，菌落边缘较为整齐。含1.0 g/L氯化铵的培养基菌丝颜色最浅，呈洁白色，菌丝纤弱，菌落边缘不整齐。含1.5 g/L 氯化铵的培养基颜色较浅，呈浅褐色，菌丝粗壮程度仅次于0.5 g/L，菌落边缘却最整齐。因此，在本次实验中0.5 g/L的氯化铵更利于暗褐网柄牛肝菌菌丝生长。

图4 氯化铵浓度对菌丝生长的影响Figure 4 Effect of ammonium chloride concentration on the growth of mycelium

2.3.3 维生素B1对菌丝生长的影响

维生素B1 对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长是否存在影响与氮源类型有关（图5）。在以酵母膏、牛肉膏为氮源的培养基中，维生素B1的加入对菌落直径无显著影响。但在以氯化铵为氮源的培养基中，维生素B1的加入抑制了菌丝的生长，在以硝酸铵为氮源的培养基中情况则正好相反，维生素B1的加入促进了菌丝的生长，菌落直径的差异达到显著。从菌落形态来看：维生素B1 与酵母膏、牛肉膏和硝酸铵等3 种氮源结合的培养基菌落颜色较深呈灰褐色，与氯化铵结合的培养基菌落颜色较浅呈黄褐色，菌丝粗壮程度与菌落颜色呈现相同；除维生素B1与酵母膏结合的培养基菌落边缘较为整齐外，其他培养基菌落边缘均不整齐。

图5 维生素B1对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响Figure 5 Effect of vitamin B1 on the growth of mycelium

2.3.4 不同无机盐对菌丝生长的影响

在基础培养基中分别添加MgSO4/KH2PO4和MgCl2/KCl两种组合的无机盐，发现两种培养基上的菌落直径均未达到显著差异水平（图6），且两种培养基的菌落形态较为相似，菌落颜色均呈暗褐色，且菌落边缘较为整齐，菌落较为致密。

图6 不同的无机盐对菌丝生长的影响Figure 6 Effects of different inorganic salts on the growth of hypha

3 讨论与结论

良好的培养基是获得优质菌丝的前提。张春霞等［6］认为生长良好的暗褐网柄牛肝菌菌丝应具有直径大、菌丝呈暗褐色、菌落边缘整齐、菌丝粗壮等特征。因此，本实验从这4个方面出发评价培养基的优劣。

不同于以往的研究［7］，本实验得出暗褐网柄牛肝菌的最适氮源为氯化铵。相较于有机氮源如酵母膏、牛肉膏等，氯化铵的成分简单，可被菌丝体快速利用。

一般而言，微生物在早期倾向于利用无机氮源，中期微生物的代谢酶系已经建立，微生物对有机氮源的利用率提高。因此，培养时间在一定程度上也影响了微生物对氮源的利用。本次氮源筛选试验菌丝培养仅14 d，较其他研究培养时间较短，这可能是氯化铵较其他氮源更能促进菌丝生长的原因。另外，多篇报道显示牛肝菌的适宜氮源为氯化铵，如点柄粘盖牛肝菌［8］、厚环乳牛肝菌［9］等。相较于氯化铵，本次实验硝酸铵对菌丝生长的促进作用较弱，可能是菌丝对NO-3的利用效率较低导致。NO-3在利用氮源时需要经过硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用［10］，而NH+4则不需要。具体机制有待进一步探究。

维生素B1 是大型真菌中酶进行多种生命活动时的重要成分，对菌丝生长主要起促进作用。目前，大多数研究还集中在探究单一维生素种类对真菌生长的影响［11⁃13］，很少分析维生素和其他营养元素结合时对菌丝生长的影响。本实验发现维生素B1 在和不同氮源结合时对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响差异显著，与酵母膏、牛肉膏、氯化铵结合时不促进菌丝生长，与硝酸铵结合时显著促进菌丝生长，这可能是因为菌丝在无维生素B1 的添加或添加量较少时就能对前3 种氮源完全利用的缘故。这也暗示在日后的实际应用中应注意加入培养基营养元素的种类，考虑是否加入维生素作为辅助，避免适得其反的效果。

本次还对无机盐对菌丝生长的影响进行了探究，选取MgSO4／KH2PO4和MgCl2／KCl 互为对照，结果表明，两种无机盐组合无论在菌落直径还是菌落形态上差异都不显著。从节约生产成本的角度出发，建议以价格相对低廉的MgCl2／KCl 作为无机盐进行菌丝培养较为适宜。