大鼠脊髓鞘内置管不同固定方式和不同置留时间的比较

叶先才，刘胜兵，闵继斌

（1 嘉兴学院医学院 浙江 嘉兴 314000）

（2 嘉善县中医院 浙江 嘉兴 314000）

脊髓鞘内置管有助于将微量或小分子药物定期导入蛛网膜下腔，从而研究药物对脊髓的结构和功能影响。例如，胡兴国等脊髓鞘内给予米诺环素探讨了对脊髓G蛋白偶联受体激酶2 表达的影响[1]。脊髓置管是研究脊髓相关结构功能较常用、且给药效果较理想的手段[2]。研究发现，脊髓鞘内给药的导管型号或导管进入的途径和方式不同，其对实验大鼠的生存率和脊髓的结构均有不同程度的影响[3]。其中，寰枕后膜置管因导管在脊髓鞘内穿过较长的距离直到腔腰椎膨大处，易对脊髓结构会造成破坏，严重的还会引起大鼠瘫痪[4]。该置管方式对于研究周期较长、给药频繁而需长期置留的实验而言，导管长久置留是否影响脊髓结构尚不清楚。此外，对于如何固定体外部分导管，使其完整长久留存，从而保障整个实验过程中经导管给药也是很多脊髓置管实验中需要考虑的问题。有研究通过去除颅顶骨膜，在矢状缝两侧钻孔后钉入螺丝，将导管体外部分固定于两螺丝钉之间，固定在颅骨[5]。这种颅骨钻孔的固定方法存在手术时间长，实验操作难度较大等不足。本研究通过体外导管缝合固定，探求一种简单实用、适合大鼠单笼饲养的体外导管固定方法。通过大鼠脊髓鞘内置管，比较两种不同导管体外部分固定方式的固定效果，同时观察PE-10 管置留与否对脊髓结构的影响，为后续脊髓置管实验提供参考。

1.材料和方法

1.1 实验动物

雄性健康SD 大鼠30 只，2019 年11 月购自浙江省医科院，体重300 ～320 g，分笼饲养，自由饮食。

1.2 材料

PE-10 管，50 μl 微量注射器，止血钳，镊子，剪刀，手术刀片，纱布，水合氯醛，苯巴比妥钠。

1.3 方法

实验分为三组，每组10 只，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/100 g，麻醉后四肢固定于大鼠固定板，颈部用5mL 注射器针管垫起。常规消毒，颈部剪毛，脱毛器脱毛，70%酒精擦拭。手术刀片划开两耳中线下的头颈部皮肤，分离颈部肌肉后，找到寰枕后模，手术钳夹住两侧肌肉。用1mL 注射器针头挑破寰枕后膜至清亮脑脊液流出。取PE-10 导管12 cm 由经针头挑破的寰枕后膜插入6 ～8 cm，以角针、3-0 手术线缝合切口，用石蜡封固PE-10 管暴露的末端，防止脑脊液流出。术后10万单位青霉素0.5 mL 肌肉注射。

1.3.1 PE-10 两种管体外固定方式：第一组大鼠PE-10 管体外部分用手术线固定缝合于头颈部皮肤；第二组大鼠PE-10 管体外部分直立于头颈部；实验第三组大鼠为第一组和第二组各随机取5 只大鼠组成。

1.3.2 PE-10 管脊髓存留对脊髓的影响：第一组和第二组保留PE-10 管至实验结束，第三组术后第3 d 从脊髓拔除PE-10 管。

1.3.3 脊髓石蜡切片，HE 染色观察：术后第四周分别各组取2 只大鼠，戊巴比妥钠麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），固定后，剪开背部皮肤，分离肌肉，取出脊髓L4/5 部位后固定于4%多聚甲醛固定液，固定48h 后，石蜡切片，HE 染色。

2.实验结果

2.1 不同固定方式对术后大鼠的死亡率的影响

为了探讨不同固定方式对实验动物死亡率的影响，我们分析了头颈部皮肤固定和缝合固定后直立两种方式对大鼠死亡率的影响。结果如表1 所示，术后第2d 至实验结束，第一组大鼠死亡数2 只，死亡率为13.3%，未见动物瘫痪；第二组未见动物死亡，但观察到后肢瘫痪大鼠1 只；瘫痪率为6.7%。此外，还观察到存活大鼠术后手术切口红肿有渗出液。术后2 周，刀口基本愈合。两组无显著差异（P＞0.05）

表1 实验大鼠死亡与瘫痪统计[n（%）]

2.2 缝合固定后直立的方式明显优于缝合固定于头颈部皮肤

PE-10 管体外部分用手术线缝合固定于头颈部皮肤的实验组，2 周后，3 只大鼠的PE 管体外部分被损；2 只大鼠的PE 管体外的长度存留不足1cm，不利于后续给药。PE 管直立于外的实验组，PE 管存留完好，结果见表2。数据分析表明，缝合固定后直立的方式明显优于缝合固定于头颈部皮肤的固定方式（P＜0.05）。

表2 PE-10 管体外两种不同固定方式的比较

2.3 不同置管方式和置管时间对脊髓结构无影响

为了进一步探讨不同置管方式和置留时间是否对脊髓的解剖结构产生明显影响，我们对不同分组的动物术后第四周进行了病理解剖观察。结果如图1 所示，各组大鼠脊髓无明显结构破坏，脊髓组织结构正常。

图1 脊髓置管对脊髓结构的影响

3.讨论

自Yaksh 等通过大鼠鞘内置管给药后[6]，脊髓鞘内置管在神经相关的研究中得以广泛应用，其中，寰枕后膜置管具有手术操作简单、插管入口明显、置管便捷等优点。但有文献报道，该置管方式的早期实验动物存在一定的死亡率，约3%～5%[4]。此外，因实验动物的个体有差别，易造成插入位置偏深，导致术后动物出现后肢瘫痪；甚至引起脊髓的结构损伤。但本研究的结果表明，经寰枕后膜置管未见明显的脊髓结构损伤，这可能与我们在手术过程中对相关操作存在的脊髓损伤等潜在风险显著重视有关。存留于体外部分的置管常因实验动物的抓挠而脱落或被咬断。研究发现，经第5 ～6 椎间脊髓鞘内置管，超过半数以上的体内置管和部分体外存留导管在实验后的4d 中被破坏[7]。因此，选择有效的体外固定方法，对脊髓置管的保存有重要意义。本实验发现，术后大鼠单笼饲养后，固定于头颈部皮肤的PE-10 管，由于大鼠抓脱而影响后续通过PE-10 管给药，而PE-10管直立于外，则PE-10 管保持完好，PE-10 管的直立优于固定于头颈部皮肤。

综上所述，PE-10 管体外部分直立优于固定于头颈部皮肤，脊髓鞘内PE-10 管置留时间的长短对脊髓结构无显著影响。