慢性乳腺炎患者分离克氏棒杆菌的耐药性及临床意义研究*

牟良群，林美芳，孙 滨，王云英

(重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 400010)

慢性乳腺炎发病机制尚未完全明确，与细菌学的关系长期以来备受争议，但近年来不断出现慢性乳腺炎合并感染克氏棒杆菌的病例报道。据文献报道，克氏棒杆菌菌株几乎全部从慢性乳腺炎患者脓液中分离获得[1-2]。克氏棒杆菌为亲脂性棒杆菌，需在高脂环境中生存[3]；亲脂性是此菌的主要致病特征，经产妇女的乳腺组织进一步发育很可能是细菌易感的原因，富含脂肪的乳腺组织为其生长提供了最佳生存环境。在本院就诊的慢性乳腺炎患者中越来越多的患者合并感染克氏棒杆菌。本研究收集本院从慢性乳腺炎患者中分离的克氏棒杆菌19株，对其耐药性进行了分析，并探讨了其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1菌株来源 收集2018年9月至2020年3月本院从临床住院慢性乳腺炎患者中分离的克氏棒杆菌 19株，同一患者多次分离该菌株仅收集第1次菌株纳入研究。其中浆细胞性乳腺炎(PCM)患者12例(63.2%，PCM组)，肉芽肿性乳腺炎(GM)患者7例(36.8%，GM 组)。

1.1.2仪器与试剂 3D血培养瓶、E-实验抗菌药物(法国梅里埃公司)、哥伦比亚血平板、血MH平板(赛默飞)、吐温-80等；BacT/Alert 3D 血培养仪(法国梅里埃公司)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(BD布鲁克)、聚合酶链反应仪、凝胶成像仪(美国 Bio-Rad 公司)等。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 采用回顾性分析对PCM和GM中分离出的19株克氏棒杆菌感染患者进行临床资料的收集及分析，临床诊断以病理检查结果为准。临床资料包括患者年龄、性别、临床诊断、抗生素的使用、治疗方式、生育情况、淋巴结肿大、月经、乳头溢液、乳头内陷、喝酒、吸烟、愈后和复发等。

1.2.2细菌培养、鉴定与药敏试验 采集患者术中脓液培养接种于哥伦比亚血平板，同时，将脓液注入血培养瓶中培养；采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱及测序方法进行细菌鉴定，16sRNA扩增引物序列：16sRNA-F：TGCCAGCAGCCGCGCGGTAATAC，16sRNA-R：CGCTCGTTGCGGGACTTAACC，测序结果在GenBank上进行比对(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)。药敏试验采用E-实验方法，严格遵照美国临床和实验室标准化协会推荐的琼脂稀释法，但细菌在含LHB的MH肉汤中生长不良，所以，采用E-实验法，按M45-A3[4]进行结果判定，质控菌株为肺炎链球菌 ATCC 49619和大肠埃希菌 ATCC 25922。

1.2.3克氏棒杆菌的改良培养 参照文献[4]的方法，克氏棒杆菌在含1%的吐温-80哥伦比亚血平板或含吐温的脑浸液肉汤中生长良好，配制含1%的吐温-80哥伦比亚血平板，观察细菌生长情况。

2 结 果

2.12组患者一般资料比较 PCM组患者年龄26～41岁，GM 组患者年龄23～32岁。2组患者年龄、抗生素的使用等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者一般资料比较

2.2克氏棒杆菌的鉴定

2.2.1细菌的菌落和镜下形态 细菌的菌落呈无色至灰色，无光泽，光滑，圆形，凸面，直径小于1 mm，不溶血。显微镜观察为细长革兰阳性杆菌，形状不规则，整体呈棒状，端部膨大，无芽孢，抗酸染色阴性。见图1。

A.克氏棒杆菌菌落形态；B.克氏棒杆菌显微镜下形态。图1 细菌的菌落和镜下形态

2.2.2质谱和测序鉴定 克氏棒杆菌鉴定值大于1.9，参照文献[1]准确鉴定为克氏棒杆菌；测序结果与质谱鉴定结果一致。

2.3药敏试验结果 19株克氏棒杆菌对万古霉素、利奈唑胺、庆大霉素、利福平敏感率均达到100.0%，对青霉素、环丙沙星、四环素、美罗培南敏感率分别为20.0%、30.0%、10.0%、60.0%，而对红霉素和克林霉素的耐药率均为100.0%。见表2。

表2 克氏棒杆菌对10种抗菌药物的药敏试验结果

2.4生长情况 19株克氏棒杆菌在1%吐温-80哥伦比亚血平板明显比哥伦比亚血平板生长良好。

续表2 克氏棒杆菌对10种抗菌药物的药敏试验结果

3 讨 论

慢性乳腺炎是指区别于急性乳腺炎的一种病因不明、病程迁延、好发于育龄经产妇女非哺乳期的一种乳腺炎症。临床最常见的非特异性乳腺炎——PCM和GM通常认为与感染的关系不大[2，5]，但本研究结果显示，较多PCM和GM患者脓液中分离得到克氏棒杆菌。有研究表明，此菌常常是在疾病发展早期被单独分离出来[1-2]，患者受感染后诱发自身免疫反应，促使乳腺小叶损伤加速[6-7]。PCM和GM伴克氏棒杆菌感染患者由于细菌扩散增长与时间成正比，单纯手术治疗完全清除难度相当大，且乳房切除术会影响乳房外形及其功能，大多数患者无法接受。因此，及时明确其病因，确定是否与感染有关，对患者的治疗具有重要意义。

本研究结果显示，克氏棒杆菌主要从PCM(12例)和GM(7例)患者脓肿期脓液中分离获得，分离阳性率明显高于其他国内文献报道[8]，与本研究所采取的培养方式相关，采用2种方法培养：(1)将脓液直接接种到哥伦比亚血平板；(2)将脓液接种到血培养瓶中，并将其放入全自动血培养箱中进行增菌培养。为进一步提高克氏棒杆菌检出率，本研究改良了此菌的培养方式，参照文献[4]的方法，配制含1%吐温-80羊血琼脂平板，结果显示，此菌在吐温琼脂平板上生长良好。因此，作者建议对慢性乳腺炎患者的脓液培养需使用新组合培养方式以提高克氏棒杆菌检出率，针对此类患者其脓液培养采取血培养瓶加吐温琼脂平板。本研究对细菌的鉴定主要采用BD布鲁克质谱(MALDI-TOF)和测序2种方法，结果显示，二者一致性较好。

本研究结果表明，19株克氏棒杆菌对万古霉素、利奈唑胺、庆大霉素、利福平敏感率均较高，达100.0%；对青霉素、环丙沙星、四环素、美罗培南敏感率分别为20.0%、30.0%、10.0%、60.0%；对红霉素和克林霉素耐药率均为100.0%，与文献报道基本一致[8]。应避免使用青霉素和头孢菌素类抗生素，万古霉素、利奈唑胺、庆大霉素和利福平虽敏感性较高，但由于克氏棒杆菌独特的分子结构，与分枝杆菌同属革兰阳性菌，形态结构上与结核分枝杆菌具有一定相似性，分类学上亲缘性较近；且在细胞内以特殊的方式寄生致病，在嗜中性粒细胞浸润的肉芽组织脂质空泡中存活，而非炎症组织中[9-10]。因此，只有高亲脂性及高分布容积的药物才能在这种环境下达到足够的抑菌浓度[11]。在以上4种药物中万古霉素、庆大霉素属水溶性抗生素，在体内不能到达感染部位，而利福平具有较高亲脂性，且到目前为止，仍是抗分枝杆菌的主要药物，但单用某一种抗分枝杆菌药物易产生耐药性，中华预防医学会妇女保健分会2016年发布的《非哺乳期乳腺炎诊治专家共识》指出，对反复发作形成窦道、病理学检查确诊为导管周围乳腺炎或乳腺导管扩张症患者采用抗分枝杆菌治疗已成共识，治疗方案可选择异烟肼、利福平、乙胺丁醇或吡嗪酰胺，临床多使用三联药物。

对临床表现为弥漫型伴棒状杆菌感染的GLM患者，在常规治疗基础上加用三联抗分枝杆菌药物能在一定程度上抑制棒状杆菌的生长及繁殖，从而降低乳房局部炎性反应，进而保证更好的乳房外形。克氏棒杆菌引起的感染特点表现为脓肿形成、肉芽肿性炎症、进展成窦道或瘘管形成等。使治疗过程中创伤性操作增加，乳房外形破坏率增加，甚至部分患者切除乳房才能避免反复复发，而保守治疗常采取免疫抑制剂，所需时间较长，存在不能完全将乳腺炎症病灶清除的问题，易导致疾病多次复发[12]。本研究PCM和GM患者中均有患者合并感染克氏棒杆菌，且2组患者一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。19例患者中采用脓肿切开引流加抗生素治疗17例，疗效良好；1例患者因反复复发行乳腺区段切除加利福平、异烟肼和乙胺丁醇三联抗棒状杆菌治疗，1例患者未使用抗生素直接行乳腺区段切除。因此，明确慢性乳腺炎是否合并细菌感染，尤其是克氏棒杆菌感染，对此病的治疗具有重要意义，对合并克氏棒杆菌感染患者如已形成脓肿者推荐采用脓肿切开引流加抗生素治疗，特别是利福平、异烟肼和乙胺丁醇三联抗棒状杆菌治疗，可抑制棒状杆菌的生长及繁殖，降低乳房局部炎性反应，避免切除乳房，保证更好的乳房外形，从而提高患者的生活质量。

PCM、GM与克氏棒杆菌感染关系密切，因此，临床医师需及时送检合格标本进行培养鉴定，明确是否合并细菌感染；检验工作者需提高对病原微生物的检验能力，及时、准确鉴定细菌。准确、快速地检出此菌对患者的诊治具有重要意义。