宁动颗粒对抽动-秽语综合征模型大鼠行为学的影响

李梦盈，姜莉苑，李继君

（1.衢州职业技术学院，浙江 衢州324000；2.上海交通大学医学院附属儿童医学中心中西医结合科，上海200127）

抽动秽语综合征（tourette's syndrome，TS）是一种发育神经精神障碍，临床上以面部、四肢、躯干等部位肌肉出现不自主、快速、无目的的反复抽动等刻板行为为主症，少部分患儿可伴有喉部异常发声、猥秽言语等症状的综合症候群。TS患儿常伴有多动、强迫等行为及情绪障碍，如注意缺陷多动障碍（ADHD）、强迫性障碍（OCD）、情绪障碍及其他自伤行为。部分患者抽动可导致终生疾患，约5%的患儿有生命危险症状，严重影响生活质量[1]。近年来，TS发病率呈现逐年升高的趋势，因此，尽早选择安全有效的治疗方法具有重要意义。目前TS主要采用西医药物治疗，其中氟哌啶醇、利培酮、硫必利等精神类药物已成为治疗TS的一线药物，西药能抑制患儿大脑皮质运动区的兴奋性，发挥减轻抽动症状的效果。但氟哌啶醇服用后产生的不良反应与药物干预剂量、时间密切相关，目前临床上常见的不良反应包括帕金森样震颤、嗜睡、坐立不安、头痛、强迫性张口、斜颈、反复徘徊、伸舌、消化道症状等，导致患儿无法耐受，最终中断治疗。

宁动颗粒是李安源教授的经验方[2-3]，本课题组前期研究发现[4-5]，宁动颗粒可影响TS模型大鼠抽动刻板行为及学习记忆能力，其作用机制与抑制多巴胺（DA）系统的兴奋性密切相关。本研究探究宁动颗粒对抽动-秽语综合征模型大鼠行为学的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取清洁级雄性Wistar大鼠24只，由上海儿童医学中心动物实验中心提供，SPF级,合格证号：11401500007810，体质量（100±20）g，动物房室温（23±2）℃，相对湿度45%～65%，采用12 h光照黑暗自动循环。将宁动颗粒（深圳三九中药有限公司，批号：201603212）用蒸馏水稀释为实验所需的浓度后使用；氟哌啶醇（Hal，上海安心八福药业有限公司，国药准字H86749384，规格：2 mg/片）灌胃药液配制：氟哌啶醇2 mg+0.9%氯化钠溶液2 mL（将1片Hal研磨成细末，溶入2 mL 0.9%氯化钠溶液），现配现用；阿朴吗啡（Apo，美国Sigma公司，批号：079K6547）注射液配制：阿朴吗啡1 mg+无菌生理盐水1 mL，充分溶解后避光使用[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 TS动物模型24只Wistar TS模型大鼠随机分为阿朴吗啡组（CTR，n=8）、氟哌啶醇组（Hal，n=8）和宁动颗粒组（NDG，n=8）。3组大鼠均腹腔注射阿朴吗啡1.0 mg/（kg·d），连续注射药物4周。在造模情况下，同时，进行药物干预。CTR组给予等量蒸馏水；NDG组给予宁动颗粒370 mg/（kg·d）（相当于临床用量的15倍）；Hal组给予氟哌啶醇10 mg/（kg·d）（相当于临床用量的10倍）。各组大鼠均灌胃药物干预，每天上午10：00药物干预1次，药物灌胃连续干预8周。

1.2.2 大鼠抽动刻板行为测试在给大鼠注射阿朴吗啡及在干预治疗15 min后，开始观察大鼠的刻板活动，包括：咬、嗅、舔（不包含理毛）、挖洞、迅速移位、急速跳跃等。评分标准参照文献[8]报道。评分方法：0分，无刻板运动；1分，动物鼻嗅增加，常伴有抬头活动；2分，动物不连续地嗅增加，伴有身体抬高；3分，动物不连续地嗅增加，伴有头和身体原地抬高运动的舔，偶然的快速的爆发性的自发活动（2～5步）；4分，动物连续地嗅、咬、舔、摇头及反复的身体抬高、爬墙；5分，动物连续地嗅、咬、舔、摇头及连续地身体抬高、爬墙，并伴有前爪不着地。

1.2.3 认知及其他行为测试①开场试验：制一个底为60 cm×60 cm的正方形、高为40 cm的木箱，用线将箱子底部分为20 cm×20 cm的9个正方形小格子，在正式实验前1天，将大鼠放进9个方格中最中央的格子内20 min以适应箱子的环境，从而减少大鼠因对环境陌生而产生焦虑不安的情绪，进而影响其正常的活动水平。正式实验开始时，将每只大鼠放进最中央的格子内，通过摄像机对大鼠5 min内的实际活动情况进行行为摄像，刻录成光盘后，通过盲法观察和记录大鼠在中央方格内停留的时间、大鼠直立次数、穿越格子的数量、梳理毛的次数。在每次大鼠测试结束后，清洁测试区域，同时，注意保持测试期间的噪声及周边光线亮度的一致性[9]。②Morris水迷宫实验：迷宫是一个圆形恒温的乳白色铁制水池，直径120 cm，高50 cm，按东、南、西、北4个方向将水池平均划分为4个象限（NE、SE、SW、NW），再将直径10 cm，高度为30 cm的圆形平台放入迷宫水池中，注入乳白色不透明液体，使圆形平台隐没在水下2 cm，水温（20±2）℃，平台可置于任意一个象限中央。在正式实验之前，在水池中不设立平台，让大鼠在池内自由游60 s，以消除焦虑适应新的环境。实验第1～4天，连续4 d，将大鼠从4个不同的象限下水，通过拍摄记录大鼠寻找并站到隐藏平台所需的时间。若大鼠在120 s内找到平台，则让其在平台上停留30 s，使大鼠观察并记住空间的参照物。若大鼠在120 s内未能找到平台，则由测试者引导上平台，并同样停留30 s。每天测试连续4次，当天的成绩为4次的平均值，进而监测大鼠的学习记忆能力[10-12]。

1.3 观察指标观察对4组大鼠行为学的影响。

1.4 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，开场试验采用单因素方差分析，Morris水迷宫采用一般线性模型的Repeated Measures ANOVA方差分析，比较用t检验，两组间的相关性分析用双变量相关行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TS模型大鼠抽动行为评估连续注射Apo 4周后大鼠出现持续且稳定的刻板活动。药物干预第5周，Hal组和NDG组与CTR组相比，大鼠刻板活动明显减弱（P＜0.05），药物干预第8周差异最大（P＜0.05），见表1。

表1 3组TS模型大鼠抽动行为比较（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

表1 3组TS模型大鼠抽动行为比较（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

注：与CTR组比较，aP＜0.05

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2.2 TS模型大鼠开场试验中的行为表现NDG组干预8周后，大鼠在中央停留时间显著增加（P＜0.05）；Hal组药物干预前后大鼠在中央停留时间比较差异无统计学意义；干预8周后，NDG组穿格子次数减少，与CTR组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Hal组穿格子次数与CTR组比较差异无统计学意义；NDG组干预后，大鼠直立次数显著减少（P＜0.05）。Hal组药物干预前后各项目比较差异无统计学意义；干预8周后，NDG组大鼠修饰次数显著减少（P＜0.05）。Hal组药物干预前后比较差异无统计学意义，见表2。

2.3 TS模型大鼠水迷宫试验中的行为表现3组大鼠随着多次重复练习，找到平台的时间均减少，均低于第1天的时间（P＜0.05），且NDG组找到平台的时间明显低于Hal组和CTR组（P＜0.05），但Hal组和CTR组比较差异无统计学意义，见表3。

表2 3组TS模型大鼠开场试验行为表现比较（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

表2 3组TS模型大鼠开场试验行为表现比较（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

注：与干预前比较，aP＜0.05

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表3 3组TS模型大鼠水迷宫行为表现比较（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

表3 3组TS模型大鼠水迷宫行为表现比较（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

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3 讨论

本研究观察发现，TS大鼠出现连续稳定不自主且快速的抽动刻板行为，这是由于Apo的诱导增强了黑质-纹状体DA系统功能，从而诱导并增强了大鼠的刻板行为，连续注射Apo，进而使大鼠出现连续且稳定的抽动行为，然后运用NDG及Hal对抽动模型大鼠进行治疗，结果表明，治疗组和非治疗组在刻板行为方面有显著性变化，两组均能明显减弱Apo诱导的TS模型大鼠抽动刻板行为，与CTR组相比，治疗组抽动行为在抽动的持续时间、频率及复杂程度均显著减弱。提示NDG在治疗TS抽动刻板效果与西药Hal疗效相当，但NDG安全性高于Hal。

临床上患TS症状的患儿通常伴有学习困难问题，而智力水平的高低则直接影响患儿的学习成绩。有文献[13]报道发现，TS患儿的智力水平大多处于正常或边缘状态，且即使TS患儿的智力水平在正常范围内，但与正常儿童相比仍处于较差状态。记忆是人脑对过去活动、感受、经验的印象累积，通常分为长时记忆、短时记忆及瞬时记忆。有研究表明TS患儿的瞬时记忆和短时记忆可能存在一定程度的缺陷[14]。Bomtcin RA[15]对28例TS患儿采用Halsetad儿童神经心理成套量表测试，发现TS患儿的触觉操作评分异常，提示TS患儿存在空间记忆能力缺陷。刘智胜等[16]采用韦氏儿童记忆量表对TS患者进行检测，发现患儿总记忆商数虽在正常范围，但在背数和视觉再生测验结果明显低于正常水平，提示抽动患儿的短时记忆存在缺陷。此外，背数异常可反映患儿注意能力缺陷，这可能与TS共患ADHD存在一定的相关性。本研究显示，NDG干预可有效改善TS模型大鼠学习及记忆能力。

开场试验是观察多动行为再现使用最多的试验，该试验主要反映大鼠在陌生环境下自发活动能力，通常以大鼠直立次数、穿越格子数等指标反应其自发活动能力，大鼠格子数穿越次数多代表大鼠的水平活动越高，而直立次数可表示大鼠垂直活动水平能力，直立次数越多表示大鼠垂直活动水平越高。在开场实验中，TS模型大鼠表现出多动、焦虑及激惹状态，其在中央停留时间短，穿格子数、直立次数及修饰次数多。大鼠在NDG干预8周后，其在中央停留时间较药物干预前明显增加，说明NDG能有效改善TS模型大鼠焦虑及激惹等状态，可能与NDG改善多巴胺系统紊乱有关；同时，NDG组穿越格子数、修饰次数和直立次数也随之显著减少。说明NDG能明显改善TS模型大鼠多动及刻板的症状。

Morris水迷宫是测评学习记忆能力最经典的实验，通过定位航行试验反应其空间记忆的保持能力。每天从4个不同点将大鼠分别放入水中若干次，并记录大鼠找到隐蔽在水下平台所需要的时间。随着训练的增多，大鼠逐渐学会找到固定位置的平台，进而形成对空间位置的认知。本研究结果显示，在药物干预8周后，3组大鼠随着多次重复的练习期间，找到平台的时间均减少，且与第1天找到平台时间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），说明大鼠均有学习和记忆的能力，且NDG组找到平台的时间更短，表明NDG改善TS模型大鼠学习和记忆能力强于Hal组和CTR组；Hal组找到平台的时间与CTR组相比差异无统计学意义，说明Hal改善或者提高大鼠学习记忆效果显著。提示TS大鼠存在学习记忆能力的缺陷，与临床现象相符，NDG改善TS模型大鼠学习和记忆能力强于Hal。

综上所述，宁动颗粒可显著抑制TS模型大鼠抽动刻板行为，且可改善TS模型大鼠多动及学习记忆能力。