胶体金法快速检测蔬菜中哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺残留的应用研究

章 慧,丰东升,张唯谊,陈美莲,王艺娇

(上海市农产品质量安全中心,农业部食品质量监督检验测试中心(上海),上海201708)

农药是把双刃剑,在提高农作物产量保证人类食物供给方面做出了巨大的贡献,但若使用不当,农药残留问题会严重危害广大人民群众的身体健康。 在合作社加农户的种植方式下,施肥用药难以监管,特别是叶菜类蔬菜,流通领域停留时间极短,若不经农药残留检测就进行销售,极易导致食品安全事故。 因此,利用农药残留快速检测技术对产地输出及外地流入当地市场的蔬菜实施全面监控,实现安全监控“全覆盖”意义重大。

目前,广泛应用的农药残留快速检测方法为酶抑制率法,受酶特异性的影响,该方法主要用于检测有机磷和氨基甲酸酯两类农药[1],但该方法易受酶试剂和酶活力的影响,检测结果可信度较低[2]。 胶体金免疫层析技术是20 世纪末发展起来的一种固相标记免疫检测技术[3],具有简单、快速、准确、无污染、成本低等优点,被广泛应用于医学检测、食品安全及动物疫病诊断等领域[4]。 但目前应用胶体金免疫层析法检测蔬菜农药残留的试纸种类较少,制约了该检测技术的进一步推广[5]。

哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺均为《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)[6]在蔬菜产品中有限量规定的农药品种,本项目对胶体金法快速检测蔬菜中哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺的技术开展应用研究,旨在为农产品质量安全监管和农产品生产者安全自检工作提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

随机在市场上购买结球甘蓝、辣椒、黄瓜、番茄、芹菜、西葫芦、苦苣、红米苋、韭菜、大蒜、菜薹、结球莴苣、生菜、洋葱、葱、菜豆、胡萝卜、马铃薯各3 份,液相色谱-串联质谱法确认哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺检出为阴性后,再用胶体金快速试纸条验证。 哒螨灵快速检测试纸条(YRSPN1028)、咪鲜胺快速检测试纸条(YRSPN1025)、嘧霉胺快速检测试纸条(YRSPN1017)购自深圳市易瑞生物技术股份有限公司;哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 仪器与设备

胶体金法读数仪YR-100,深圳市易瑞生物技术股份有限公司;液相色谱-质谱(LC-MS),沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 胶体金法

原理:在检测微孔中冻干金标抗体,在硝酸纤维素膜的检测线(T 线)和对照线(C 线)处分别包被哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺抗原和羊抗鼠IgG 二抗。 样本中若含有哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺,则在微孔温育过程中与胶体金标记的单克隆抗体结合,从而抑制金标抗体与硝酸纤维素膜上包被的哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺抗原的结合。

前处理:每种蔬菜样品称取(2 ±0.1)g,剪碎或搅碎后分别加入到15 mL 或50 mL 离心管中;加入8 mL YRSPN 样品通用提取液,充分震荡混匀,即为待测液。 重复3 次。

检测:从配套的检测试剂盒里取出红色微孔试剂,依次加入200 μL 待测液,用一次性吸管上下抽吸混匀后反应3 min(20—40 ℃)。 取出试纸条,将其插入上述红色微孔中,反应6 min(20—40 ℃)。 从微孔中取出试纸条,轻轻刮去其下端的吸水海绵,并进行结果判读。 若T 线颜色较C 线颜色深,则结果为阴性(未检出);若T 线颜色较C 线颜色浅,或T 线不显色,则结果为阳性(检出);若T 线、C 线均不显色则检出结果无效。

1.3.2 液相色谱-串联质谱检测方法

哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺的检测按照《水果和蔬菜中450 种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB∕T 20769—2008)[7]规定的方法进行。

1.4 灵敏度试验

《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)[6]中对哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺在蔬菜中的残留量均有规定。 本试验针对三种农药在各类蔬菜中的限量标准,每种蔬菜均设置4 个加标浓度,即本底浓度(空白)、1∕2 限量值浓度或产品标识检出限浓度(如产品检出限即为该药物在某种蔬菜上的限量值即设定1∕2 限量值浓度,如产品检出限低于该药物在某种蔬菜上的限量值则设定产品标识检出限浓度)、限量值浓度和2 倍限量值浓度。 除标准中明确限量的蔬菜品种外,另选几种市面上常见的蔬菜作为验证样品开展灵敏度试验。 每份试验样品均做3 个重复。 每种农药各选定9 种蔬菜做为灵敏度试验样品。

1.5 实物阳性样品验证试验

选择生产过程中未施用过农药的生菜,对其喷洒主要药效成分为哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的农药品种,喷洒3 d 后采摘,将其运送到实验室,先用液相色谱-串联质谱法对样品中农药残留的含量进行测定,再将样品稀释到产品最低检出限的0.5 倍、1 倍、2 倍水平。 喷洒了不同农药的基质均做3 个平行,每个检出水平做10 个平行。

1.6 交叉反应测试

哒螨灵、咪鲜胺没有结构类似物,嘧霉胺的结构类似物为嘧菌环胺,因此选择嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、多菌灵、啶虫脒、吡虫啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利共10 种农药开展交叉反应测试。 将克百威、毒死蜱、多菌灵、啶虫脒、吡虫啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利这9 种农药配制成为浓度均为20 μg∕mL 的混合标准储备液。 再将混合标准储备液分别稀释到2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,待用。 用哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺胶体金试纸条分别测试不同浓度的混合标准溶液,观察是否有交叉反应。 另将嘧菌环胺配置成0.50 mg∕kg 的标准溶液,用嘧霉胺胶体金试纸条进行测试,观察是否有交叉反应。

1.7 结果评价

按照国家食品药品监督管理总局制定的《食品快速检测方法评价技术规范》,评价胶体金方法的灵敏度、特异性、假阳∕阴性率及与参比方法的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同基质的灵敏度

由表1—3 可知,不同蔬菜基质中哒螨灵的检出限均能达到2.0 mg∕kg,咪鲜胺的检出限均能达到1.0 mg∕kg,嘧霉胺的检出限能达到0.05 mg∕kg,3 种农药验证的检出限均能达到与胶体金试剂条说明书中描述的最低水平。

表1 哒螨灵的灵敏度试验结果(n=3)Table 1 Sensitivity test results of pyridaben

2.2 实验室加标假阳性率

随机在市场上抽取9 种蔬菜各3 份,液相色谱-串联质谱法确认为阴性后再用胶体金快速试纸条进行检测以验证其假阳性率,结果见表4,哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的假阳性率均为0%。

2.3 实验室加标假阴性率

准确称取哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺标准品,用甲醇溶解,均配置成浓度为100 μg∕mL 的标准溶液,再将标准溶液加入到已确认为阴性的蔬菜样品中,使其在蔬菜样品中的终浓度分别为2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,然后用胶体金试纸条进行加标验证,结果见表5。 哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的假阴性率均为0%。

表2 咪鲜胺的灵敏度试验结果(n=3)Table 2 Sensitivity test results of prochloraz

表3 嘧霉胺的灵敏度试验结果(n=3)Table 3 Sensitivity test results of pyrimethanil

2.4 实物阳性样品

如表6 所示,实物阳性样品验证哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺残留的假阳性率均为0%,哒螨灵和嘧霉胺假阴性率均为0%,仅咪鲜胺在1 mg∕kg 测试浓度下有1 例出现假阴性,胶体金法检测3 种农药残留与参比方法相比均无显著性差异(χ2＜3.84)。

2.5 交叉反应测试

用100 根哒螨灵胶体金试纸条测试1.6 中配置的2.00 mg∕kg 混合标准溶液,结果均为阴性;用100 根咪鲜胺胶体金试纸条测试1.6 中配置的1.00 mg∕kg 混合标准溶液,结果均为阴性;用100 根嘧霉胺胶体金试纸条1.6 中配置的0.05 mg∕kg 混合标准溶液,结果均为阴性。 用100 根嘧霉胺胶体金试纸条进行测试0.50 mg∕kg 的嘧菌环胺标准溶液,结果有12 根试纸条显示阳性,交叉反应率为12%。

表4 哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的假阳性率(n=3)Table 4 The false positive rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表5 哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的假阴性率(n=3)Table 5 The false negative rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表6 哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的实物阳性样品的验证结果Table 6 The verification results of physical positive samples of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

3 结论与讨论

目前,哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的检测多采用气相色谱或液相色谱法[8-10],该类方法不仅操作复杂,检测时间长,还必须在固定的实验室中操作,无法满足基层农产品质量安全监管的需要。 本研究表明,胶体金法快速检测蔬菜中哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的残留,其检测结果与液相色谱法串联质谱法检测结果相比无显著性差异,且更为简便、快速,15 分钟内即可完成一件样品从前处理到读取结果的全部检测工作。另外,该方法的灵敏度较高,基本能满足一般基质中哒螨灵、咪鲜胺和嘧霉胺的检测限量要求,但是,《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)[6]中规定黄瓜中哒螨灵的残留限量标准为0.1 mg∕kg,而胶体金产品的检出限仅能达到2.0 mg∕kg;大蒜中咪鲜胺的残留限量值为0.1 mg∕kg,而产品检出限仅能达到1.0 mg∕kg,这会导致实际应用中部分阳性样品的漏检。 另外,《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)[6]中规定薹和辣椒中咪鲜胺的残留限量值为2.0 mg∕kg,而该产品检出限为1.0 mg∕kg;除马铃薯中嘧霉胺的残留限量值与产品检出限相同,为0.05 mg∕kg 外,其他蔬菜的限量值均大于该检出限,这会造成检出结果假阳性率偏高,而检出的阳性样品往往需要送到专业的第三方实验室用仪器方法进行确认,容易耽误产品上市时间,失去快速检测的意义。 因此建议针对限量值不同的蔬菜开发针对性的检测产品,产品的检出限不能过高或过低,检出限达到限量值的水平即可,这样更利于基层监测人员第一时间判断检测结果。

胶体金快速检测法操作简便,且灵敏度高,检测人员只需稍加培训即可进行检测操作,适于基层人员开展蔬菜中农药残留的快速检测。 但该方法目前能检测的农药品种不多,与实际生产的需求还有一定差距,市场上经权威机构验证的产品也很少,需要进一步提高该类产品在生产和基层一线的适用性以满足当前我国蔬菜生存和监管的实际需求,实现源头监管的理念。