普通齿蛉和单斑巨齿蛉(广翅目：齿蛉科)卵块及1龄幼虫形态学研究

王淑颖，曹成全，郑灿平，贺佳倩，袁靖泽，叶保华*

(1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安 217018；2. 乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614004；3. 山东农业大学科技处，山东泰安 217018；4. 吉首大学生物资源与环境工程学院，湖南吉首 416000)

广翅目Megaloptera分为齿蛉科Corydalidae和泥蛉科Sialidae 2科，齿蛉科含有26属235种及6亚种(刘星月, 2008; 杨定和刘星月, 2010)。广翅目齿蛉科的巨齿蛉属Acanthacorydalis和大型齿蛉属Neoneuromus的幼虫被民间称为“爬沙虫”(曹成全, 2014)，是一种珍稀的药食两用昆虫，在四川攀西地区等广大区域具有上百年的食用历史(曹成全, 2019)，治疗小儿夜尿、老人尿频、治疗体虚等如有神效(四川省盐边县政协文史资料编委会, 1990)，且具有其他很多药理作用(杨冬梅等, 2012; 石晏丞等, 2019)。

在产业化应用的过程中，爬沙虫的幼虫是主要产品虫态，因此，之前的研究中，中国有巨齿蛉属(东方巨齿蛉Acanthacorydalisorientalis(McLachlan, 1899))和齿蛉属(普通齿蛉NeoneuromusignobilisNavás, 1932和锡金齿蛉Neoneuromussikkimmensis(van der Weele, 1907))末龄幼虫和蛹的形态描述(Cao and Liu, 2013; Caoetal., 2016; Caoetal., 2018)。卵块和1龄幼虫作为引种的重要虫态，其形态鉴定是爬沙虫人工繁育和产业化应用过程中的重要工作。

本文选取了齿蛉科的中国特有种普通齿蛉和单斑巨齿蛉AcanthacorydalisunimaculataYangetYang，1986作为齿蛉属和巨齿蛉属(爬沙虫的主要类群)的代表，对其卵块和1龄幼虫进行了形态描述和比较。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019年7-8月，在四川省乐山市峨眉山(N 29°37′26″, E 103°23′31″)、贵州凯里三棵树镇(N 26°34′1″, E 108°03′44″)，每个种分别采集至少50个健康卵块，妥善带回实验室进行研究，并按照相关专利技术进行孵化(曹成全, 2018)，将每个种的卵块逐个放置在贴标签的孵化槽里，孵化出1龄幼虫。

1.2 物种分子鉴定

1.2.1DNA提取

将1龄幼虫剪取胸腹部肌肉，取完后用消毒后的小剪刀剪碎，再采用基因组DNA试剂盒(北京天根生物科技)提取总的基因组DNA。

1.2.2PCR扩增以及测序

扩增引物COI序列通用为C1-J-2183 (5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′)和TL2-N-3014 (5′-TCCATTGCACTAATCTGCCATATTA-3′)(张杰, 2017)。整个PCR反应体系为25 μL，包括2×ES Taq Master Mix (cye)12.5 μL，引物各取了1.0 μL (0.4 μmol)，ddH2O 8.5 μL，样品2 μL。扩增程序为94℃，1 min；94℃，0.1 min，55-0.5℃，0.5 min，72℃，1 min，20 cycles；94℃，0.5 min，45℃，0.5 min，72℃，1 min，20 cycles；72℃，10.0 min，4℃，1 cycles(注：ES Taq DNA Polymcrase扩增效率为2 kb/min)。经琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物再送至生工生物技术中(上海)公司成都生工测序部进行纯化和双向测序。

1.2.3数据处理

接收到公司测出的样本序列，然后在Genbank上对比得出样本(1龄幼虫)种类，并推论出相对应的卵块种类。

1.3 形态测定方法和数据处理

利用游标卡尺测量卵块的长、宽、高，然后在LY-WN超清显微系统(成都励扬精密机电有限公司)下进行拍照，并用Photoshop和Illustrator软件处理照片。每个物种的1龄幼虫取30头，放在DW-25L262型医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)内-22℃冰冻5 min至死亡，待其自然伸展，在体视显微镜(SDPYOP SZM)下调整姿势后，放在LY-WN超清显微系统下进行拍照。最后利用ToupView软件将照片按照相应的分辨率测量卵块和1龄幼虫各部位细微长度。采用Excel 2010整理数据。

2 结果与分析

2.1 物种鉴定结果

将测序的DNA序列与Genbank上广翅目已测物种基因序列对比，确定本研究的物种为普通齿蛉NeoneuromusignobilisNavás，1932和单斑巨齿蛉AcanthacorydalisunimaculataYangetYang，1986。

2.2 普通齿蛉的卵块及1龄幼虫形态描述

2.2.1卵块及卵粒的形态特征

普通齿蛉卵块有多种类型(图1)，可分为椭圆形(图1-A)、螺形(图1-B)、卵圆形(图1-C)、圆形(图1-D)。其中，椭圆形类型最多，占采集全部卵块的47.1%；其次是圆形，占25.5%；卵圆形占17.6%，最少的是螺形，只占9.8%。卵块的形状受附着的芦苇叶的宽度的影响(图3)，在采集的卵块中，70.6%卵块底部宽大于等于附着的芦苇叶宽，其上卵块细长，呈椭圆形、螺形、卵圆形(图3-B，C，D)，29.4%是卵块底部宽小于芦苇叶宽，卵块呈圆形(图3-A)，成虫可以在充足的空间进行产卵。最外层卵粒上覆一层白色物质，不同类型白色覆盖物厚度分布差异不大，通常情况下，白色覆盖物两头厚1.44±0.06 mm，周边略薄为0.53±0.06 mm，两头厚度是两侧2～3倍。以比重最大的椭圆形类型为例，一般情况下，卵块的长度为17.96±2.36 mm，宽度为13.45±1.82 mm，高度为6.74±1.13 mm。卵块底面由8层卵粒构成，每层卵粒排列呈椭圆形向内部集中。卵粒从卵块一侧开始向外部呈射线分布层层有规律地紧密的排列在一起(图4-A)。卵块侧面由5层组成，每层卵粒朝着卵块侧边底部集中，彼此紧密相连，尤其在其侧边缘。底面三层卵粒呈水平状，侧边缘呈弧形，整体构成半圆环形(图4-B)。一般卵块约有700～1 000个卵粒。卵粒之间有白色的、质软的泡沫状卵囊，有缓冲的作用，避免因挤压等外力作用损坏卵粒，孵化后的卵壳呈蜂窝状，呈乳白色，易脱落(图2-D)。卵粒的形状呈圆柱形，两端钝圆，呈淡黄色，在卵的半径面上并无大头针状物质。卵粒大小几乎相等，长为1.17±0.04 mm，宽为0.36±0.02 mm，长宽比约为3 ∶1。在卵块孵化过程中，卵粒会在同一侧前端最先出现黑色眼点，随着时间推移，表皮开始皱缩，卵粒颜色会由金黄色逐渐向黑褐色转变(图5)，卵块孵化整个过程大概为18 d左右。

图1 普通齿蛉卵块类型Fig.1 Egg mass types of Neoneuromus ignobilis注：A，椭圆形；B，螺形；C，卵圆形；D，圆形；从左往右依次是其类型的背面、腹面、侧面。Note: A, Oval; B, Spiral; C, Egg-shape; D, Circle; From left to right were the back, ventral and lateral sides of the egg mass type.

图2 普通齿蛉卵粒和卵壳Fig.2 Eggs and their mass of Neoneuromus ignobilis注：A，背面卵粒；B，腹面卵粒；C，单个卵粒；D，孵化后的卵块。Note: A, Eggs in the dorsal view; B, Eggs in the ventral view; C, A single egg; D, Egg mass after hatching.

图3 芦苇叶上的不同普通齿蛉卵块Fig.3 Different egg mass of Neoneuromus ignobilis on reed leaves

图4 普通齿蛉卵块模式图Fig.4 Pattern of egg mass of Neoneuromus ignobilis注：A，腹面图；B，切面图。Note: A, Ventral view; B, Sectional drawing.

图5 普通齿蛉卵块孵化过程中颜色变化Fig.5 Color changes during the hatching process of egg mass of Neoneuromus ignobilis注：A，第1天；B，第8天；C，第15天；D，第16天。Note: A, First day; B, Eighth day; C, Fifteenth day; D, Sixteenth day.

2.2.21龄幼虫的形态特征

普通齿蛉的1龄幼虫(图6-A，B)体型扁长，整体呈透明状，可以清楚地看出体内脂肪及两侧气管，体长为3.82±0.04 mm，体宽为0.56±0.01 mm。头部宽0.60±0.01 mm，头部长0.67±0.01 mm。眼点明显，呈黑色，位于头部两侧。头部两侧有一对上颚，上颚上有4个齿，每个齿前端呈棕黄色，下端呈透明。大颚外侧是触角，共有3节，各节长度不一，其中基部柄节最粗短，为0.02 mm；梗节为0.16 mm，棒状，与柄节相连一端到1/2处呈黄褐色，与鞭节相连一端呈透明，较为粗大；鞭节最长，为0.17±0.01 mm，细长，呈黄褐色，向端部逐渐变细。前胸呈长方形，长0.56±0.01 mm，宽0.55±0.02 mm，明显比中后胸大，胸部背板骨化较强。从中胸到尾部，在其腹部背面呈棕黄色，且有白色的带状裸露区，外侧裸露区一般排列成一对丝条状，内侧裸露区呈一对狭窄的带状。1龄幼虫一共有10腹节，前8腹节两侧都有一条气管鳃，每条气管鳃长度相似，约为0.64±0.09 mm，透明状，每条气管鳃靠近尾端都有黄褐色斑点；第10腹节有一对尾钩，黄褐色。约14 d后，1龄幼虫会从前胸背板处破皮而出，蜕皮为2龄幼虫，蜕皮完整，两侧有明显的气管(图6-C)。2龄幼虫头部皆为黄色，腹部气管鳃旁出现细丝状毛簇，每个部位有两簇，每簇三条，共6条毛簇(图6-D)。

图6 普通齿蛉1龄幼虫Fig.6 First-instar larvae of Neoneuromus ignobilis注：A，背面观；B，腹面观；C，蜕皮；D，2龄幼虫。Note: A, Dorsal view; B, Ventral view; C, Molting; D, Second-instar larvae.

2.3 单斑巨齿蛉的卵块及1龄幼虫形态描述

2.3.1卵块及卵粒的形态特征

单斑巨齿蛉卵块有单个的，呈卵圆形(图7-A，D)，一头大一头小；但也有两块相连的卵块，呈葫芦状(图7-B，E)，两边呈波浪形。卵粒底面卵块一侧1/4处开始向外部呈射线分布层层有规律地紧密的排列在一起，有9层(图8-A)。卵块侧面扁长，由6层组成，每层卵粒朝着卵块侧边中部集中，彼此紧密相连(图8-B)。卵块最外层卵粒一侧向内，一侧翘向外，其上覆有一层薄薄的白色物质，在0.27±0.05 mm，卵块背面可以清楚地显出最外层卵粒向外翘起的排列，使得卵块表面看上去如许多大小相似椭圆形的突起均匀地分布在表面，颜色呈暗白色。卵粒细长,呈圆柱状，黄白色，卵粒端钝圆(图7-C),一般卵块约有1 200～1 500粒卵块。卵块长为21.02±2.58 mm，宽为15.22±3.29 mm,高为5.73±0.54 mm。卵粒长1.89±0.03 mm，宽0.52±0.04 mm，长宽比约为3.5 ∶1，一端钝圆，一端较尖钝。卵粒之间存在白色的泡沫状卵囊，可以起到缓冲保护卵粒的作用，待卵粒完成孵化后，就会剩下泡沫状卵囊(图7-F)。

图7 单斑巨齿蛉卵块和卵粒Fig.7 Egg mass and eggs grain of Acanthacorydalis unimaculata注：A，单个卵块背面；B，两个相连卵块背面；C，单个卵粒；D，单个卵块腹面；E，两个相连卵块腹面；F，孵化后的卵。Note: A, Dorsal view of a single egg mass; B, Dorsal view of two joined egg masses; C, A single egg grain; D, Ventral view of a single egg mass; E, Ventral view of two joined egg masses; F, Egg mass after hatching.

图8 单斑巨齿蛉卵块模式图Fig.8 Pattern of egg mass of Acanthacorydalis unimaculata注：A，腹面图；B，切面图。Note: A, Ventral view; B, Sectional drawing.

2.3.21龄幼虫形态学特征

单斑巨齿蛉的1龄幼虫(图8)，整体狭长，体长为3.8±0.17 mm ，体宽为0.68±0.03 mm，整体呈透明，可以清楚地看见其内部消化道、脂肪等内部结构，全身附满大小长度不一的毛刺。头长为0.81±0.07 mm，头宽为0.73±0.05 mm。眼点明显，呈黑色，位于头部两侧偏上部分。上颚共有4齿，大小不同，4个齿的顶端都呈黄褐色，下端呈透明状。触角为3节，长短不一，柄节为0.03 mm，粗短，位于基部；梗节为0.20±0.01 mm，棒状，与柄节相连一端到1/2处呈黄褐色，与鞭节相连一端呈透明，较为粗大；鞭节为0.20±0.01 mm，细长，呈黄褐色，端部为尖。前胸长0.64±0.01 mm，宽0.47±0.01 mm，透明无花纹。从中胸到尾部，其腹部背面呈棕黄色，腹部背面裸露区位和颜色分布不稳定。腹部共有10节，分节明显，前8腹节每节两侧各有一条鞭毛状细长的气管鳃，每条气管鳃长度相似，约为0.64±0.09 mm，内部有一条乳白色的气管，但腹部无毛簇结构。第10腹节有1对黄色的尾钩以及一对透明尾须。

单斑巨齿蛉在卵孵化过程中，最先在卵粒窄端1/4处出现黑色眼点，即卵粒窄端为幼虫头部端。随着时间推移，卵粒表皮逐渐皱缩，卵粒颜色也是由金黄色逐渐向黑褐色转变(图9)，甚至还可以清晰地看见幼虫黄褐色大颚和尾部(图9-C)。

图8 单斑巨齿蛉1龄幼虫Fig.8 First-lnstar larvae of Acanthacorydalis unimaculata注：A，背面；B，腹面。Note: A, Dorsal view; B, Ventral view.

图9 单斑巨齿蛉卵过程中内部变化Fig.9 Color changes during the hatching process of egg of Acanthacorydalis unimaculata注：A，第1天；B，第8天；C，第15天；D，第16天。Note: A, First day; B, Eighth day; C, Fifteenth day; D, Sixteenth day.

2.4 普通齿蛉与单斑巨齿蛉在卵块和1龄幼虫的形态特征比较

普通齿蛉与单斑巨齿蛉在卵块和1龄幼虫的形态上有着较大差异，可以通过对比进行分类区分。

对于两种卵块区别最大的地方为普通齿蛉的卵块是单斑巨齿蛉的卵块3/4，单斑巨齿蛉的白色覆盖层比普通齿蛉的薄，再加上最外层卵粒向外伸出，从而使得单斑巨齿蛉卵块表面看上去是有许多大小相似椭圆形的突起均匀地分布在表面。

对于两属卵粒来说，普通齿蛉的卵粒是单斑巨齿蛉的卵粒2/3，普通齿蛉的卵粒数量在700～1 000粒，单斑巨齿蛉卵粒数量在1 200～1 500粒，除了大小数量差异外，其外形和孵化过程都相似，都呈圆柱状，最初的卵粒都呈黄色，卵块孵化整个过程都在18 d左右。

对于两种1龄幼虫差异来说，主要在于腹部背面裸露区位置以及有无气管鳃花斑。单斑巨齿蛉1龄幼虫腹节呈深褐色，腹部背面裸露区和颜色分布不稳定，8对气管鳃靠近末端相同位置无斑点；普通齿蛉的1龄幼虫腹节背面呈棕黄色，且白色的线状裸露区较稳定，外侧裸露区一般排列成一对丝条状，内侧裸露区呈一对狭窄的带状。每一腹节都是相似分布，其1龄幼虫的8对气管鳃末端相同位置有黄褐色花斑。

表1 普通齿蛉与单斑巨齿蛉卵块和1龄幼虫形态特征的比较

3 结论与讨论

通过之前研究发现炎黄星齿蛉ProtohermesxanthodesNavás，1913、角新齿蛉Corydaluscornutus(Linnaeus)、全色新鱼蛉Neohermesconcolor等卵粒半径偏中心处均有个大头针状物(Baker and Neunzig, 1968; 陈申芝, 2012)，而普通齿蛉和单斑巨齿蛉的卵粒均无此结构。推测不同种属的广翅目昆虫的卵粒是存在外部差异的，这需要进一步对广翅目多个种属进行深入研究，将对广翅目分类具有一定的参考价值。

普通齿蛉的卵块基本是单个附着在芦苇叶上，通过观察其卵块多种形态与其接触的芦苇叶宽度有关。在采集的卵块中，70.6%的卵块底部宽大于等于芦苇叶宽度，其形状为椭圆形、螺形、卵圆形，还有29.4%的卵块底部宽小于等于芦苇叶宽度，卵块形状呈圆形。由此可见，普通齿蛉产卵时会在芦苇叶的宽度范围内，充分利用芦苇叶的宽度。锯角黑鱼蛉Nigroniaserricornis(Say)也是如此，其喜在特定树种上产卵，并且种内不同个体在选择产卵叶片的长宽和高度上存在差异(Pennuto and Stewart, 2001)，雌虫对产卵地点的选择可能与卵的保护及提高卵的孵化率有关(刘星月, 2008)，具体关系还需要进一步统计分析。单斑巨齿蛉的卵块则是多个相连附着在桥底，可能由于产卵雌虫数量较多和产卵地点面积大小所限制，导致卵块呈多个相连一起，但也有可能是由于同一雌虫产多个卵块。产卵量在不同种间及不同个体间存在一定的差异，通常情况下1头雌虫至少可以产下1个卵块，但有时可能产多块，如大星齿蛉Protohermesgrandis(Thunberg)和美星齿蛉ProtohermesimmaculatusKuwayama的雌虫可以产1～4个卵块(刘星月, 2008)。导致单斑巨齿蛉的卵块多个相连是由于空间密度问题还是雌虫产多个卵块相连，需要进一步对其产卵行为进一步探索。

普通齿蛉与单斑巨齿蛉的卵块最外层都是白色物质包裹内部卵粒，其他种类如大星齿蛉Protohermesgrandis(Thunberg)和美星齿蛉、美洲的角新齿蛉的卵表面都有这样的白色或褐色的覆盖物(Hayashi, 1992; Mangan, 1992)，这类覆盖物的作用可能与卵的保护与保水有关(刘星月, 2008)。但也有些卵块是裸露的，表面无覆盖物，如炎黄星齿蛉、栉角鱼蛉Chauliodespectinicornis(Linnaeus)、锯角黑鱼蛉(Baker and Neunzig, 1968; Pennuto and Stewart, 2001; 陈申芝等, 2012)。卵块外表面有无白色覆盖物能否成为广翅目分类的标准，还需要大量的工作进行研究。另外，外层白色或褐色的覆盖物与叶蝉(半翅目：叶蝉科)虫体外表白色物质相似，叶蝉是从马氏管产生并在后肠蜕皮后分泌，再通过后足将其涂抹虫体外表，其主要物质是蛋白质和脂质，达到防水、防菌、减少水分蒸发等作用(Rakitov, 2009)。目前还未有关对广翅目白色覆盖物的相关研究，对于其是如何形成、分泌等机理值得进一步研究。

对于大龄幼虫来说，两种爬沙虫每一腹节两侧都有一对毛簇进行张闭合呼吸，一共7对(Cao, 2018)，而通过对两种爬沙虫1龄幼虫的比较，发现两种爬沙虫的1龄幼虫腹面腹节处皆无毛簇，且发现毛簇是在2龄开始才出现毛簇，且与大龄幼虫的毛簇不太相同，呈细丝状，位于呼吸鳃下端。可见，毛簇的发育过程是逐步变化的，下一步会对其发育过程进行详细研究。

总之，通过对普通齿蛉和单斑巨齿蛉卵块与1龄幼虫的形态特征描述以及比较，可以在售卖卵块和种苗(1龄幼虫)时可以简单进行判别，对产业化具有一定参考价值，但目前研究种类有限，可能会与其他种类发生混淆，接下来需要对广翅目其他种属的卵块和1龄幼虫的形态学特征比较研究，这将对广翅目分类以及广翅目产业化做出巨大贡献。对于卵和外层白色覆盖物的化学和营养成分及其开发等还需进一步研究。

致谢：感谢乐山师范学院生命科学学院2015级生物技术班李旭月同学对本实验的贡献。