南疆三地棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性频率监测

宁忠雄，李维政，梁 赫，秦子昕，王冬梅，李海强，刘 冰，路 伟*

(1. 新疆农业大学农学院，棉花教育部工程研究中心，乌鲁木齐 830052；2. 新疆农业科学院植物保护研究所，农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830052；3. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

新疆是我国不可替代的产棉区和商品棉基地，根据国家统计年鉴的最新数据，2020年新疆棉花产量达516.1万t，占全国棉花总产量的87.3%，连续26年位居全国第一。南疆棉区Bt棉的种植比例较高，接近80%(姚永生，2017)。棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)作为一种杂食性害虫，其为害严重制约着棉花、玉米、小麦等经济作物的产量，给农业生产造成巨大的经济损失(郭予元，1998；Wuetal., 2008)。与内地棉区相比，新疆棉花的种植模式较为单一，常年大面积连片种植，棉铃虫在Bt棉花的选择压力下存在产生Bt抗性的风险。

Bt杀虫蛋白是苏云金芽孢杆菌Bacillusthurngiensis在芽孢形成过程中产生的具有较高杀虫谱特异性的杀虫晶体蛋白，其中研究最多的是Cry1Ac蛋白(Sanahujaetal., 2011)。梁革梅(2000)在实验室利用Cry1Ac蛋白混合饲料对棉铃虫连续多代筛选后，其抗性水平可达数千倍以上。Gunning (2005)研究发现棉铃虫对CrylAc毒蛋白产生了275倍的抗性。美国孟山都公司在印度棉田中发现棉红铃虫Pectinophoragossypiella(Saunders)对Bt棉也产生了抗性(Bagla, 2010)。李国平等(2018)研究发现，2013-2016年河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率小于0.0021，表明抗性基因频率处于较低水平。但对河北邱县棉铃虫种群抗性监测中，抗性等位基因频率为0.1990，为高抗性基因频率(潘利东等，2013)。Li等(2010)对新疆库尔勒的棉铃虫种群抗性监测中发现1个抗性个体。对新疆石河子和莎车的棉铃虫田间种群进行Bt抗性监测，尚未发现棉铃虫产生抗性个体(王冬梅等，2012)。

因此，本文从田间分别采集南疆库尔勒、阿克苏、泽普三地的棉铃虫单雌系，以Cry1Ac毒蛋白作为人工饲料，利用单雌系F1代并结合诊断剂量法进行棉铃虫田间种群抗性个体检测，以期为新疆Bt棉区棉铃虫的抗性治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 棉铃虫田间种群的采集和饲养

2020年8月下旬至9月下旬在新疆库尔勒、阿克苏中国农业科学院新疆综合实验基地和喀什泽普县奎依巴格镇棉田，通过1 000 W金属卤化物探照灯诱集棉铃虫成虫。

将诱集到的雌蛾单头放在干净的一次性纸杯中，在纸杯上做好编号，以10%糖水在杯中饲喂，在杯口用纱布覆盖，方便产卵，每一头雌蛾所产的卵及其发育而来的后代作为一个单雌系用于F1代生测。在温度为26～27℃；相对湿度40%～50%；光周期14 L ∶10 D条件下饲养。

1.2 Cry1Ac杀虫蛋白

含Cry1Ac型Bt ICP 20%的MVPII水剂，由美国Mycogen公司提供。

1.3 F1代生物测定

生物测定方法参照Li等(Lietal., 2004)，采用饲料混合法进行生测，饲料配方参照梁革梅等(1999)配制，配制2份饲料：一份是不含Cry1Ac杀虫蛋白的饲料为对照，另一份是含有诊断剂量浓度为1.0 μg/mL Cry1Ac蛋白毒饲料。将稀释的Cry1Ac毒蛋白，混入到50℃左右的饲料中，搅拌均匀，倒入白瓷盘中，冷却的两种饲料分别装入5 mL饲养管中，饲养管的管盖需扎小孔，小孔大小为幼虫无法逃跑为宜，在每个饲养管中接入1头刚孵化的幼虫，共接入35头。6 d后观察F1代幼虫发育龄期，根据头壳和体长划分幼虫龄期，发育龄期参照Li等(2004)的方法转换为幼虫对应的发育级别。

1.4 统计方法

根据F1代生物测定结果，计算三地棉铃虫单雌系在两种饲料上的幼虫平均发育级别(公式1)，用SPSS软件在P值为0.05水平下分析F1代幼虫在正常饲料与在Cry1Ac蛋白毒饲料上的平均发育级别线性相关性。

相对平均发育级别

(公式1)

根据公式2计算棉铃虫单雌系在两种饲料上的幼虫相对平均发育级别，结合三地2015-2019年玉米种植面积占当地农作物种植面积的比例(从三地国民经济和社会发展统计公报中查阅)，分析棉铃虫种群的敏感度。

相对平均发育级别

(公式2)

2 结果与分析

2.1 F1代棉铃虫田间种群生物测定分析

在库尔勒、阿克苏、泽普三地诱集棉铃虫雌蛾分别有129头、200头、180头，根据F1代幼虫生物测定的要求，三地诱集的雌蛾分别有100头、106头、92头产的卵孵化出足够的幼虫。由图1可知，三地绝大多数棉铃虫单雌系幼虫相对平均发育级别介于0.29～0.73之间，三地F1代幼虫在正常饲料上的平均发育级别平均值分别为4.70、4.66、5.01，Cry1Ac饲料上的平均发育级别平均值为2.42、2.14、2.45。

计算库尔勒、阿克苏、泽普三地棉铃虫F1代单雌系在正常饲料和Cry1Ac饲料上幼虫平均发育级别的线性相关性，三地棉铃虫线性方程分别为y=0.2258x+1.3619 (r=0.3311，P=0.0132)、y=0.2819x+0.8272 (r=0.3600，P=0.0100)、y=0.2252x+1.3203 (r=0.3870，P=0.0300)，表明库尔勒的棉铃虫F1代单雌系在正常饲料和Cry1Ac饲料上的平均发育级别相关性显著，阿克苏、泽普的棉铃虫棉铃虫F1代单雌系在正常饲料和Cry1Ac饲料上的平均发育级别具有相关性，说明棉铃虫取食正常饲料的平均发育级别越高，则取食Cry1Ac饲料的平均发育级别也越高。

图1 棉铃虫种群F1代单雌系在正常饲料和Cry1Ac饲料上的幼虫平均发育级别的相关性Fig.1 Correlation for average rating between families on NBT and Cry1Ac diets in populations for the F1 generation of Helicoverpa armigera

新疆玉米和Bt棉花的生长期较为重合，在粮棉间作区域，玉米可以提供较多的棉铃虫敏感种群以稀释棉铃虫Bt抗性基因，因此玉米是新疆Bt棉区棉铃虫庇护所最适宜的作物。根据公式2计算库尔勒、阿克苏、泽普三地棉铃虫种群相对平均发育级别(见图2)。结果表明，三地棉铃虫种群的相对平均发育级别的平均值分别为0.5210、0.4935、0.4623，说明三地棉铃虫种群敏感度：泽普>阿克苏>库尔勒。三地2015-2019年玉米种植面积占当地农作物种植面积的平均比例也印证了上述实验结果，泽普玉米种植比例最高为21.6%，说明泽普的玉米田可以提供较多的棉铃虫敏感种群(见表1)。

图2 棉铃虫F1代幼虫相对平均发育级别分布图Fig.2 Distribution of the relative average development rating for F1 larvae of Helicoverpa armigera

表1 库尔勒、阿克苏、泽普玉米种植面积比例(%)

2.2 抗性基因频率的计算

库尔勒、阿克苏和泽普三地分别有57个、106个和92个棉铃虫单雌系进行F1代生物测定，每个单雌系至少交配一次，携带4个配子，2个配子来自身，另外2个配子来自与其交配的雄蛾，分别有57×4、106×4个和92×4个基因组，三地F1代棉铃虫幼虫相对平均发育级别均小于0.8。因此，估测库尔勒、阿克苏和泽普三地的棉铃虫对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率均小于0.001 (见表2)。

表2 根据棉铃虫对1.0 μg/mL Cry1Ac饲料的反应而计算的抗性基因频率

3 结论与讨论

本研究对库尔勒、阿克苏、泽普三地棉铃虫Bt抗性基因频率进行监测，结果表明：三地棉铃虫在Cry1Ac饲料上的平均发育级别介于2.14～2.45之间，相对平均发育级别介于0.46～0.52之间，且库尔勒的棉铃虫相对平均发育级别最高，说明库尔勒棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白有一定的耐受性。泽普棉铃虫相对平均发育级别最低，说明在Bt棉区多种植玉米，可以有效稀释棉铃虫Bt抗性基因。

Li等(2010)应用单雌系F1/F2法，在2005年、2006年和2009年对莎车、库尔勒的棉铃虫Bt抗性监测中，2005-2006年棉铃虫F1代、F2代幼虫相对平均发育级别都小于0.8，但2009年在库尔勒发现1个相对平均发育级别≥0.8的抗性个体，估测库尔勒棉铃虫种群Bt抗性基因频率低于0.8×10-3。王冬梅等(2012)在2010年对石河子的棉铃虫种群和2011年对莎车的棉铃虫种群Bt抗性监测中，两地的幼虫相对平均发育级别都小于0.8，估测的棉铃虫种群抗性基因频率低于10-3。本研究中库尔勒、阿克苏、泽普三地棉铃虫种群F1代所有幼虫个体相对平均发育级别都小于0.8，个别的单雌系的幼虫相对平均发育级别高于均值，这可能是微效基因作用的结果(Gould, 1998)。但三地棉铃虫相对平均发育级别均高于王冬梅等人(2012)监测的石河子、莎车两地棉铃虫种群，说明库尔勒、阿克苏、泽普三地棉铃虫对Bt的敏感性有所降低，需要进一步跟进监测和关注。

庇护所策略能显著降低棉铃虫Bt抗性进化，通过稀释抗性基因，减少抗性遗传的可能(Wu, 2005; Wu, 2007; Jinetal., 2015)。Bt棉花、玉米、小麦都是新疆主要种植的经济作物，小麦只有部分生长期与Bt棉花重合，不能有效起到庇护所的作用，玉米能在时间和空间上为棉铃虫庇护所(吴莉莉，2011)。研究表明，如果粮棉间作区内玉米种植比例小于5%，同样不能起到庇护所的作用(Gould，2000)，棉铃虫的Bt抗性风险会大大增加。李国平等人(2018)对河南省新乡市的棉铃虫种群Bt抗性进行监测，发现棉铃虫对Cry1Ac蛋白敏感性有所增强，其重要因素可能是当地玉米、花生等庇护所种植面积占比不断增加，提供敏感棉铃虫种群不断增多所引起的。本研究泽普的玉米种植比例最高为21.6%，可以提供较多的棉铃虫敏感种群以稀释Bt抗性基因，因此泽普的棉铃虫种群敏感度也最高。

王冬梅等(2020)研究结果表明，新疆阿克苏、库尔勒、博乐、昌吉、哈密5地棉铃虫种群对半合成抗生素类杀虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)表现为敏感；昌吉种群对拟除虫菊酯类杀虫剂三氟氯氰菊酯表现为中等水平抗性；阿克苏种群对酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺表现敏感转为中等抗性。说明5个新疆棉铃虫种群对不同杀虫剂的抗药性还处于中等较低水平，可能原因是Bt棉的种植减少了化学药剂的使用次数，而不同地区棉铃虫抗性差异较大，也可能与当地的施药水平和作物种植布局有关(王冬梅等，2012)。

Bt棉在新疆推广种植已有20年，在对新疆部分地区棉铃虫Bt抗性监测中，发现棉铃虫种群存在潜在的抗性风险(卢美光等，2000；陈海燕等，2007；Lietal., 2010；王冬梅等，2012)，因此监测棉铃虫Bt抗性演化是一项持久性的工作，可为早期抗性治理提供科学依据。与此同时，通过调整农作物种植结构，改进植棉区的种植模式，增加庇护所的种类及种植面积，都可以有效延缓棉铃虫对Bt棉的抗性。