UPLC-MS/MS 同时测定烟草中5 种新烟碱杀虫剂残留

熊 巍，张海燕，靳冬梅，韶济民，陶晓秋，庞 夙

（四川省烟草质量监督检测站，四川 成都 640001）

新烟碱类杀虫剂是一种硝基亚甲基杂环化合物，主要用于防治同翅目，鞘翅目、双翅目和鳞翅目昆虫，通过影响昆虫中枢神经系统的突触、阻止神经细胞间的传递而起效。在烟草中广泛应用的新烟碱杀虫剂有吡虫啉和啶虫脒等。2015 年，中国烟叶公司将吡虫啉和啶虫脒列为推荐农药。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）2013 年制定的农用化学品指导性残留限量（GRLs）将吡虫啉和啶虫脒纳入限量类别，烟叶中吡虫啉和啶虫脒的限量值分别为5 和2.5 mg/kg[1]。

目前，已报道的新烟碱杀虫剂检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[2]、酶联免疫法（ELISA）[3]、毛细管电泳-质谱法（CE-MS）[4]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[5-6]，涉及的样品基质主要有蜂蜜[7-11]、饮用水[12]、谷物[13]、蔬果[14]、茶叶[15]以及血液、尿液[16]、奶[17]和组织[18]等生物基质样品。烟叶中的新烟碱杀虫剂残留量也受到广泛关注，2011 年的烟草行业标准（YC/T405.1—2011）将啶虫脒和吡虫啉纳入测定范围[19]。前期也有烟草科技工作者较为关注烟叶中新烟碱杀虫剂残留量的检测方法研究。何庆等[20]建立了20%甲醇水溶液超声萃取、石墨化碳柱固相萃取、LC-MS/MS 同时测定烟叶中5 种新烟碱类杀虫剂残留的方法，检出限范围为0.005～0.009 μg/mL。王骏等[21]通过乙酸-乙腈提取、基质固相萃取净化，再采用UPLC-MS/MS 法测定了31 个烤烟烟叶样品中的啶虫脒、吡虫啉残留量，发现烟叶样品中啶虫脒检出率为1/5、检出量为0.015 5～0.243 1 μg/g，吡虫啉检出率约1/4、检出量为0.022 4～0.179 5 μg/g。

虽然烟草行业标准已将啶虫脒和吡虫啉纳入检测范畴，但标准方法需要同时测定73 种农药，为照顾多种农药的萃取效率与回收率，选择乙腈作为萃取剂，而前期的报道表明正己烷或异丙醇溶剂对新烟碱杀虫剂的萃取效果较好[8]。因此，笔者针对5 种新烟碱杀虫剂，对QuEChERS 提取法进行了改进，建立了同位素内标定量的UPLC-MS/MS 同时快速分析烟草中5种新烟碱杀虫剂残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺标准品来源于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度≥98.5%，Augsburg，德国），内标噻虫胺-d3来源于加拿大TRC（化学纯度98%，同位素纯度98%，多伦多，加拿大）；甲酸 （HPLC 级，德国Sigma 公司），异丙醇、乙腈、正己烷（色谱纯，美国Thermo-Fisher公司）；安捷伦农残试剂包（包含0.5 g 柠檬酸二氢钠、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠和4 g 无水硫酸镁）和N-丙基乙二胺（PSA）购自安捷伦公司（美国），水为超纯水。63 个烟叶样品选自全国烟叶农残普查分析样品（国家烟草质量监督检验中心提供），无农药残留烟叶样品由CORESTA 提供。

主要仪器设备有Waters ACQUITYTM 超高效液相色谱，Xevo TQ 质谱仪（美国Waters 公司），涡旋振荡器（VtexMixer 230VeU，美国Labnet 公司），离心机（Sigma 3K15，德国Sigma 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确称取新烟碱杀虫剂的标准品（精确至0.000 1 g）各10 mg，用乙腈溶解定容至10 mL，制得1.0 mg/mL 的单一标准储备液，-20℃避光保存；精密量取新烟碱杀虫剂储备液各100 μL 于10 mL 容量瓶，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 混合标准中间溶液，-20℃避光保存。准确配置噻虫胺-d3（0.99 mg/mL）氘代内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 的内标工作液，-20℃避光保存。

1.2.2 样品的提取和净化 样品前处理方法参照已报道文献[19]，具体步骤：烟叶样品粉碎后，称取2 g 样品于50 mL 旋盖离心管中，加入10 mL 超纯水，振荡到样品被水充分浸润，静置10 min。加入10 mL 异丙醇（常规的QuEChERS 法一般选取乙腈作为提取溶剂，考虑到异丙醇对于新烟碱杀虫剂的溶解性更好，在水浸润后更有利于反萃取出新烟碱杀虫剂[8]，且提取后的冷冻过程异丙醇不容易发热结块，前期试验结果也显示采用异丙醇为提取溶剂对5 种新烟碱杀虫剂有较好的回收率），并加入200 μL 内标（10 μg/mL），涡漩振荡2 min（2 000 r/min），-18℃条件下冷冻10 min；向离心管中加入0.5 g 柠檬酸二氢钠，1 g 氯化钠，1 g柠檬酸钠和4 g 无水硫酸镁，漩涡振荡2 min（2 000 r/min），离心5 min（6 000 r/min）；移取1.0 mL 上清液于1.5 mL 旋盖离心管，加入25 mg PSA 吸附剂和150 mg 无水硫酸镁，漩涡振荡2 min（2 000 r/min），离心5 min（6 000 r/min）。上清液过有机相滤膜（孔径为0.22 μm），移取200 μL 滤液于1.8 mL 旋盖色谱瓶，加入800 μL 用超纯水，混匀后用于LC-MS/MS 分析测定。

1.2.3 LC-MS/MS 条件优化 （1）色谱条件：采用Atlantis UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8 m） 反相色谱柱；柱温35℃；样品室温度4℃；进样体积2 μL。考察了反相色谱常用流动相乙腈/水体系、甲醇/ 水体系以及加入不同浓度甲酸的2 种体系对5 种目标化合物色谱保留行为的影响。（2）质谱条件：为实现目标化合物的痕量分析，选取MRM 定量模式。首先，在流动注射状态下，分别将0.5 μg/mL 的单标溶液在正离子和负离子的模式下进行全扫描，以选择合适的分子离子峰和电离方式，然后对毛细管电压、雾化气温度、锥孔电压、碰撞能等参数进行了优化。

1.2.4 绘制标准曲线 采用1.2.2 中方法处理空白烟叶样品，提取空白烟叶基质，配制质量浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的空白烟叶基质样品，采取优化后的色谱和质谱参数进行检测，以样品峰面积与内标峰面积的比值y 对相应浓度x （μg/mL）进行线性回归分析，绘制标准曲线。以3 倍信噪比确定方法的检出限（S/N＞3）。

1.2.5 检测方法验证 分别在空白烟叶样品中加入适量的混合标准溶液，使得新烟碱杀虫剂的添加量分别为50、250、1 000 μg/kg，按试验优化的条件进行处理和测定，开展加标回收试验，以验证方法的重复性和精密度。

1.2.6 分析检测方法的应用 采用优化后的样品处理和检测分析方法测定了国内外63 个烟叶样品中的5种新烟碱杀虫剂残留量。

2 结果与分析

2.1 分析条件的优化

2.1.1 色谱条件 以乙腈/水和甲醇/水为流动相时，新烟碱杀虫剂的峰宽稍宽且有一定的拖尾现象，这可能是由于新烟碱杀虫剂的叔胺基团与色谱柱固定相上残余硅醇基作用的结果。由于新烟碱杀虫剂拥有含氮基团，且具有弱碱性，在流动相中加入适量的甲酸会促进其电离，并为阳离子提供必要的质子来源，从而提高离子化效率。同时，流动相中甲酸的加入也有助于色谱柱固定相中硅醇基的质子化，较好地消除固定相与目标分析物的相互作用，从而减少拖尾现象，改善色谱峰形。研究结果显示，添加0.1%的甲酸时，色谱峰形较好，且不会产生离子抑制现象。与乙腈相比，甲醇作为流动相时，响应值稍高。因此，确定流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为0.1%甲酸甲醇溶液；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序为：0～2 min，90%～50% A；2～2.4 min，50%～30% A；2.4～4.0 min，30%～20% A；4.0～6.0 min，20%～90% A，6.0～ 8.0 min，90%～90% A。

2.1.2 质谱条件 研究结果显示，正离子模式下，[M+H]+为最强峰，选择其作为母离子进行下一步的碰撞电离；选择丰度较高、干扰较小的2 对子离子作为定性离子，丰度最高的作为定量离子，另一个为定性离子。优化后的质谱条件如下：电离方式为电喷雾正离子模式；毛细管电压为2.6 kV；雾化气温度350 ℃；雾化气流量为1 000 L/h；锥孔气流量为50 L/h；碰撞气流量为0.15 mL/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30 ms，采用正离子多反应监测模式（MRM）进行采集。5 种新烟碱杀虫剂的质谱参数和多反应监测色谱结果分别见表1 和图1。

表1 多反应监测模式下5 种农药及其内标的部分质谱参数和保留时间

图1 5 种新烟碱杀虫剂以及内标的加标样品多反应监测色谱结果

2.2 标准曲线和检出限

由表2 可知，采用改进的QuEChERS 法提取，色谱和质谱条件优化后，5 种新烟碱杀虫剂的线性关系良好，相关系数R2≥0.99，可以满足定量分析的需要；以3 倍信噪比确定方法的检出限（S/N＞3），吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺5 种新烟碱杀虫剂的检出限分别为1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg。

表2 5 种新烟碱杀虫剂的线性方程、相关系数和检出限

2.3 方法的回收率及精密度

如表3 所示，加标回收试验中5 种新烟碱杀虫剂的平均回收率为69.3%～115.9%，RSD 在1.9%～11.9%之间，可以满足烟叶样品中残留农药的分析要求。

2.4 实际烟叶样本检测结果

由表4 可知，部分样品的吡虫啉和啶虫脒有检出，其平均含量分别为0.146 和0.120 μg/g，检出率分别为11.1%和6.3%，其余农药未检出。所有样品的农药残留量均未超出CORESTA 于2013 年发布的指导性残留限量[1]。与王骏等[21]报道的结果相比，烟叶中吡虫啉和啶虫脒检出率有所下降，检出量较为一致。

表3 烟草中5 种新烟碱杀虫剂的加标回收率和精密度（n=5）

表4 检出样品中新烟碱杀虫剂的残留量 （μg/g）

3 结 论

采用UPLC-MS/MS 对烟草中5 种新烟碱杀虫剂残留量进行同时快速分析，以改良的基质分散固相萃取法（QuEChERS）提取净化样品，氘代内标定量，吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫胺5 种新烟碱杀虫剂的检出限分别为1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg，总分析时间为8 min。与报道的方法相比[20]，此方法前处理更为简单，检测限更低。利用建立的方法测定了国内外63 个烟叶样品，其中部分样品中吡虫啉和啶虫脒有检出，检出率分别为11.1%和6.3%，平均含量分别为0.146 和0.120 μg/g。这表明该方法可用于烟叶中5 种新烟碱杀虫剂的快速测定。