遵义地区肺结核合并糖尿病患者发生利福平耐药的基因突变研究

徐小溪，陈云华，陶 雪，唐 竹，龚亚东，林 牧

(贵州航天医院，贵州 遵义 563000)

肺结核(TB)与糖尿病(DM)均是常见的慢性疾病，两者并发时可相互影响，加重病情[1]。TB使DM患者的糖代谢紊乱加重，血糖水平不易控制；DM的糖代谢紊乱又易引发蛋白质和脂肪的代谢障碍，增加血液和组织内含糖量、降低血清蛋白、增高血脂水平等，进而降低免疫功能，使TB患者病情恶化[2-3]。加之日益递增的耐药结核患者，增大了疾病防控和治疗的难度[4]。

WHO统计数据显示，2018年全球48.4万例利福平(RIF)耐药结核病患者中，中国占14%，位居全世界第二[5]。而贵州省为我国结核病高发地区，发病率居全国第四，耐药率居全国第一；主要集中在遵义、毕节、铜仁和黔东南等地区[6]。RIF作为抗结核治疗方案中关键的一线药物，在结核病的治疗中一直具有重要作用，这与RIF的作用靶点RNA聚合酶 β 亚单位所编码的 rpoB 基因突变有关[7-8]。本研究选取遵义市区的TB患者，应用聚合酶链式反应(PCR)检测结核分枝杆菌(MTB)-DNA和MTB-RNA，以及rpoB 中包含RIF耐药性决定区的部分基因[9]，探究遵义地区TB患者和DM合并TB患者结核分枝杆菌 rpoB 基因的突变与RIF耐药之间的相关性，以明确遵义地区MTB RIF耐药的分子生物学特征。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 本研究收集2017年12月至2019年7月于本院呼吸与重症医学科就诊的763例TB患者的痰液或冲洗液标本，采用MTB-DNA、MTB-RNA和抗酸染色检测。排除31例重复检测者，余结果均为阳性者行RIF耐药基因检测，比较TB患者(525例)与TB合并DM患者(207例)发生RIF耐药的相关性，同时搜集纳入患者相关临床资料。TB及DM分别依据《WS 288-2017肺结核诊断》及美国糖尿病协会(ADA)制定的《糖尿病诊治指南》标准确诊，见表1。

表1 TB及DM诊断标准

1.1.2主要仪器和试剂 宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪、ABI-2710核酸扩增仪、天隆TL988荧光定量PCR仪等；MTB-DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)由成都博奥晶芯生物科技有限公司提供；MTB-RNA检测试剂盒(RNA恒温扩增)由上海仁度生物科技有限公司提供；MTB RIF耐药基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1MTB-DNA和MTB-RNA检测

1.2.1.1MTB-DNA和MTB-RNA提取 在患者痰液或支气管灌洗液标本中加入等体积的氢氧化钠(浓度为4%)，震荡混匀后静置15 min以充分液化；12 000 r/min离心10 min后弃上清液，加入1 mL清洗液(主要成分为生理盐水)混匀后12 000 r/min离心5 min后弃上清液。将沉淀分为两管，分别加入50 μL核酸提取液(用以提取DNA)和50 μL稀释液(用以提取RNA)，超声裂解10 min后，DNA提取管置于震荡金属浴中，100 ℃伴1 800 r/min震荡10 min后12 000 r/min离心5 min，RNA提取管直接12 000 r/min离心5 min，弃上清液。

1.2.1.2MTB-DNA和MTB-RNA检测方法 MTB-DNA PCR反应体系共20 μL，由探针、Taq酶、引物等共18 μL和模板2 μL构成；扩增程序为37 ℃ 300 s和94 ℃ 180 s一次循环；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s 经40个循环；50 ℃ 10 s单次循环。MTB-RNA PCR反应体系共32 μL，由探针、反转录酶、引物等共30 μL和模板2 μL构成；扩增程序为42 ℃ 60 s 40个循环恒温扩增。结果判读均为阳性者，留取DNA扩增产物于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2抗酸染色 实验由本院检验科完成。统计MTB-DNA和MTB-RNA阳性者名单，比对抗酸染色结果亦为阳性者，搜集以上患者相关临床信息。

1.2.3血糖测定 检测纳入患者任意时间血糖和FPG，依据表1的诊断标准，分为单纯TB组和TB合并DM组。

1.2.4PCR-反向点杂交

1.2.4.1PCR扩增 反应体系共25 μL，由dNTP、Taq酶、引物等共21 μL和模板DNA 4 μL构成；扩增程序为50 ℃ 120 s和94 ℃ 600 s一次循环；95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s 经30个循环；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s经30个循环；68 ℃ 600 s单次循环。RIF耐药性检测基因突变位点见表2。

表2 rpoB基因突变位点

1.2.4.2杂交和显色 将膜条编号并放入含PCR扩增产物缓冲液的15 mL离心管中。100 ℃ 10 min、59 ℃ 90 min后将膜条放入含枸橼酸钠缓冲液的50 mL离心管中，59 ℃ 轻摇洗涤15 min。将膜条放入含辣根过氧化物酶的显色液中10 min，观察相应显色点后判读rpoB基因突变情况。

2 结 果

2.1相关因素分析 TB组发生RIF耐药患者52例，其中22例伴低蛋白败血症，30例血尿酸水平升高；TB合并DM组发生耐药患者29例，其中16例伴低蛋白败血症，15例血尿酸水平升高。对比耐药TB、TB合并DM患者的性别、年龄、职业等因素和血清清蛋白等检测结果，发现40～<65岁患者较其他年龄段更易发生TB合并DM，差异有统计学意义(P<0.05)，各组其余因素组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 RIF耐药患者的一般情况[n(%)]

2.2PCR-反向点杂交检测结果 rpoB基因检测 732例TB患者，其中RIF耐药TB患者52例，RIF耐药TB合并DM患者29例。

2.3耐药基因rpoB突变位点分布 两组患者发生突变的位点无明显差异，TB合并DM组患者中有13例发生ropB531位点突变(突变率为44.83%)，有15例发生ropBS531L位点突变(突变率为51.72%)；TB组中有30例发生ropB531位点突变(突变率为57.69%)，有31例发生ropBS531L位点突变(突变率为59.62%)。TB合并DM组患者ropBS531L、ropB531位点突变率均低于TB组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。且两组均存在ropB531和ropBS531L两位点相伴突变。见图1。

图1 两组患者耐药基因rpoB位点突变情况

3 讨 论

随着人们生活方式和饮食结构的改变，TB合并DM的发生率逐年提高，不仅增强机体分解代谢、引起食欲下降、影响胰腺的分泌功能，而且糖代谢异常易引起蛋白质和脂肪的代谢失调，导致营养不良和细胞免疫功能下降，进而加重病情[10-11]。若再发生RIF耐药，将严重影响患者的治疗，不仅增加了治疗的难度和费用，而且病情难以控制，导致治愈率降低和病死率升高[12]。故早期确诊耐药结核是提高疗效的关键。相较培养法，采用分子生物学方法检测RIF的耐药位点突变，能很好地解决时效性问题，且RIF耐药分子机制比较明确，检测结果准确可靠。

本研究通过763例TB患者痰液或冲洗液标本的MTB-DNA、MTB-RNA和抗酸染色检测，结果均为阳性者行RIF耐药基因检测，TB患者525例，其中RIF耐药52例，TB合并DM患者207例，其中RIF耐药29例。基因突变位点均以ropBS531L和ropB531多见，且两位点几乎相伴突变，与国内外的报道相符[13]。本研究中TB组ropB531位点突变率(57.69%)高于福建省(53.3%)、四川省(55.87%)，低于广东省(63.22%)及广西壮族自治区(59.26%),印证了rpoB基因突变的发生频率有明显的地域差异[14-15]，不同国家和地区的基因突变频率呈现出不同差异[16]，可能与当地MTB的进化有关，同时证明了RIF耐药机制的发生与ropB基因突变有关。本研究首次统计了遵义地区TB合并DM患者发生RIF耐药的突变位点，主要以ropBS531L(51.72%)和ropB531(44.83%)为主，且相应位点的突变率低于单纯TB患者[ropBS531L(59.62%)和ropB531(57.69%)]，但差异均无统计学意义(P>0.05)，可能与样本量较少有关。

本研究还搜集了纳入患者相关临床资料，以分析其与耐多药MTB感染间的相关性。发现40～<65岁年龄区间更易发生TB合并DM，这可能与DM高发人群的年龄常分布于此区间有关[17]。同时发现与单纯TB患者相比，TB合并DM患者的血清清蛋白水平略有下降，这可能与TB合并DM患者不能充分利用葡萄糖，需分解蛋白质和脂肪提供热量，使机体清蛋白合成减少有关[18]。但因本研究样本量有限，相关结果无统计学意义，仍需扩大样本量做进一步研究。