调控萼脊兰类黄酮生物合成的MYB转录因子挖掘分析

蒋素华　牛苏燕　袁秀云　梁芳　王喜蒙　崔波

摘  要：本研究通过生物信息学方法，挖掘萼脊兰中可能调控类黄酮生物合成的MYB转录因子。从萼脊兰转录组数据库中筛选MYB转录因子，获得MYB的完整ORF，并对其蛋白理化性质、基序、功能注释、系统进化、表达特性等进行分析，并预测其功能。结果表明：在萼脊兰转录组水平上共鉴定出27个具有完整阅读框的MYB转录因子基因，萼脊兰MYB转录因子TRINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1基因均在花朵和叶片中表达上调，再根据与蝴蝶兰的系统进化关系与功能分析，预测这2个转录因子可能通过黄酮途径完成类黄酮生物合成。因此，MYB转录因子的研究对从分子水平上研究和调节类黄酮的合成具有重要意义，转录因子的应用是类黄酮生物合成基因工程中的新途径。

关键词：萼脊兰;MYB转录因子;次生代谢

中图分类号：Q946.8      文献标识码：A

Mining Analysis of MYB Transcription Factors Related to Flavonoid Biosynthesis of Sedirea japonica

JIANG Suhua1， NIU Suyan1， YUAN Xiuyun1， LIANG Fang1， WANG Ximeng2， CUI Bo1*

1. Biological Engineering Research Center， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044， China; 2. College of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450002， China

Abstract： MYB transcription factors that may regulate the biosynthesis of the flavonoids in Sedirea japonica were detected using bioinformatics methods. The complete ORF of MYB was obtained， and the physicochemical properties， motif， functional annotation， phylogenetic evolution， and expression characteristics of its proteins were analyzed， and its functions were also predicted. A total of 27 MYB transcription factor genes with complete reading frames were identified at the transcriptome level of S. japonica. MYB transcription factors TRINITY_DN38485_c0_g4 and TRINITY_ DN38485_c0_g1 were up-regulated in flowers and leaves. Then according to the phylogenetic relationship with phalaenopsis and functional analysis，it is predicted that the two transcription factors were involved in flavonoid biosynthesis through the flavonoid pathway. Therefore， the study of MYB transcription factor is of great significance to study and regulate the synthesis of flavonoids at the molecular level. The application of transcription factors is a new approach in the genetic engineering of flavonoid biosynthesis， the application of transcription factors is a new approach in the genetic engineering of flavonoid biosynthesis.

Keywords： S. japonica; MYB transcription factors; secondary metabolism

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.003

轉录因子（transcription factor）是一群能与基因5? 端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定强度在特定时间与空间表达的蛋白质分子。根据转录因子的作用特点可分为两类：第一类为普遍转录因子;第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子[1-2]。人们在植物中已经找到了很多调控黄酮类次生代谢的特异性转录因子基因，主要包括编码MYB、MYC、bZIP、WD40蛋白和锌指蛋白等基因家族[3-4]。MYB基因家族广泛存在于植物中，是植物中最大的转录因子基因家族之一。在类黄酮生物合成过程中，MYB转录因子扮演着重要角色，可调控与类黄酮合成相关的酶基因的表达，从而有效地调控类黄酮物质的生物合成。根据MYB的DNA结合结构域中不完全重复序列的数目将其分为4个亚类：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。其中，R2R3-MYB是MYB转录因子家族中最大的亚类，其在类黄酮合成中的作用已被广泛研究[5-6]。目前拟南芥、水稻和小兰屿蝴蝶兰的MYB转录因子的数据库已经建成，为其他兰科植物的研究打下了良好的基础。

类黄酮在植物中广泛存在，并广泛参与植物中花色素的形成、花香的调节、抗病、抗紫外线损伤等多种生物学过程[7]。李崇晖等[8]对不同颜色的蝴蝶石斛兰品种花朵中的类黄酮组成进行分析，推测了蝴蝶石斛兰花中的类黄酮代谢途径。钟淮钦等[9]克隆了类黄酮-3?5?-羟基化酶基因（F3?5?H），并对该基因进行了表达分析。张加强等[10]鉴定了蝴蝶兰花色苷合成的相关基因，从转录组水平揭示蝴蝶兰花色苷生物合成的分子调控机制，结果显示类黄酮生物合成中差异基因为8个，综上所述，关于类黄酮代谢途径及相关基因研究的较多，而类黄酮合成相关的MYB转录因子在植物优良性状形成及微量次生代谢物的合成中的调控研究还较少。

萼脊兰（Sedirea japonica）为兰科（Orchidaceae）萼脊兰属（Sedirea Garay & H. R. Sweet）多年生植物，总状花序从叶腋中发出，花具橘子香气，花多且花期长，因此研究类黄酮对萼脊兰花香的调节具有重要意义。目前还未见萼脊兰MYB转录因子家族基因的研究报道，本研究基于测序的萼脊兰转录组数据库信息，筛选并鉴定出萼脊兰所有MYB转录因子，并对其进行理化性质分析、蛋白基序分析、系统发育树构建以及基因表达分析，这些结果为进一步探索萼脊兰MYB基因提供理论资料。

1  材料与方法

1.1  材料

萼脊兰采自郑州师范学院观赏、药用兰花河南省重点实验室兰花种植基地。萼脊兰MYB转录因子是本实验室构建的转录组数据库。蝴蝶兰MYB转录因子家族氨基酸序列下载于蝴蝶兰信息资源（PlantTFDB）数据库（http：//planttfdb. cbi.pku.edu.cn/quick_search_result.php）。

1.2  萼脊兰MYB转录本筛选

高通量测序由上海生工生物科技有限公司完成，拼接组装后获得萼脊兰转录组，采用转录组基因ID搜索获取氨基酸序列，使用ORF Finder在线软件分析预测开放阅读框（ORF），获得具有全长氨基酸序列的萼脊兰MYB转录因子家族蛋白基因序列。

1.3  蛋白基序分析、结构预测、GO注释

运用The MEME Suite 4.12.0程序分析萼脊兰MYB家族蛋白的基序;应用结构域在线分析软件PROSITE和SMART对保守结构域进行分析。选择具有完整ORF的萼脊兰MYB转录因子氨基酸序列，利用在线工具ProtParam对蛋白进行理化性质分析;利用在线软件SOPMA对蛋白二级结构进行预测分析。使用BLAST2GO软件对筛选获得的萼脊兰MYB转录因子进行功能注释分析。

1.4  系统进化树构建及功能分析

蝴蝶兰MYB转录因子的蛋白序列从PlantTFDB数据库中下载，完整的氨基酸序列用于进化分析。利用Clustal X程序和MEGA4對萼脊兰MYB家族蛋白的氨基酸序列和下载的蝴蝶兰所有MYB转录因子的蛋白序列进行比对分析，将比对结果采用邻接法构建系统发育树。

通过萼脊兰MYB转录因子与蝴蝶兰所有MYB转录因子构建的系统进化树，筛选获得与各个萼脊兰MYB转录因子相似性最高的蝴蝶兰MYB转录因子，然后通过分析预测MYB转录因子的分子功能。

1.5  萼脊兰MYB转录因子表达分析

基于转录组数据，获取萼脊兰MYB转录因子在叶、花蕾和花朵的表达量，采用HemI 1.0.3.7软件对MYB转录因子在各组织表达数据进行分层聚类分析。

2  结果与分析

2.1  萼脊兰MYB家族成员的获得

从萼脊兰转录组数据库中共筛选出55条MYB基因序列，片段大小为205～3982 bp。通过ORF预测全长氨基酸序列，发现27条序列具有完整的ORF，片段最短的为499 bp（TRINITY_ DN34588_c1_g2_i3），编码的154个氨基酸;片段最长的为2461 bp（TRINITY_DN29682_ c0_g1_i1），编码535个氨基酸。

2.2  萼脊兰MYB转录因子基序分析

利用MEME在线软件分析了27个萼脊兰MYB转录因子家族的10个基序，基序1由50个氨基酸残基组成，其中包含3个高度保守的色氨

酸（W）残基，每个色氨酸之间间隔19个氨基酸，属于R2MYB结构域（图1C）;基序2由41个氨基酸残基组成，其中第1个色氨酸被苯丙氨酸（F）所代替，每个色氨酸之间间隔18个氨基酸，其他2个色氨酸残基高度保守，属于R3 MYB结构域（图1D）;萼脊兰21个转录因子包含基序1和基序2，这21条序列均包含R2R3结构域，该结构域是高度保守的，在该区域2（甘氨酸G）、4（色氨酸W）、8～9（谷氨酸E、天冬氨酸D）、12（亮氨酸L）、20（G）和38～44（赖氨酸K、丝氨酸S、半胱氨酸C、精氨酸R、亮氨酸L、精氨酸R、色氨酸W）等30个位点保守不变（图1）。进一步分析保守的motif序列特征发现，27个MYB转录因子均具有典型的HTH结构域。利用分析软件SMART分析发现，27个蛋白均具有DNA结合区-Myb结构域。

2.3  萼脊兰MYB家族蛋白理化性质分析

萼脊兰MYB家族蛋白的理化性质分析结果表明（表1），27个MYB家族蛋白的平均相对分子质量为32 651.65，TRINITY_DN67618_c0_g1_i1编码蛋白的分子质量最小，为17 527.05;TRINITY_ DN29682_c0_g1_i1编码蛋白的分子质量最大，为58 852.81。等电点（pI）平均值为7.37，TRINITY_ DN43325_c1_g2_i2编码蛋白的pI最小，为4.67;TRINITY_DN30733_c0_g1_i1编码蛋白的pI最大，为9.93。其中有13个MYB家族蛋白pI小于7（偏酸性），14个蛋白pI大于7（偏碱性），说明大多数萼脊兰MYB家族蛋白表现为偏碱性。MYB家族蛋白的平均疏水性值均小于0，说明27个萼脊兰MYB家族蛋白均属于疏水蛋白。MYB家族蛋白二级结构特征预测结果显示，27个萼脊兰MYB蛋白均具有α螺旋、无规卷曲、延伸链和β转角4种构型，主要由α螺旋和无规卷曲构成（所占比平均值分别为32.28%和54.01%），延伸链和β转角所占比例较小（所占比平均值分别为8.45%和5.25%），TRINITY_DN43325_c1_g2_i2和TRI NITY_DN38485_c0_g4_i2基因编码蛋白α螺旋所占比例最大，其余25个MYB蛋白均表现为无规卷曲所占比例最大。

2.4  萼脊兰MYB转录因子的GO注释分析

GO注释分析表明（图2），萼脊兰27条MYB转录因子序列中分别有22、27、27条被注释到生物过程、分子功能和细胞组分，所有的序列被进一步富集为27个功能类别，其中DNA结合功能（27个）、细胞核功能（27个）、转录作用（24个）、转录调节（17个）、转录因子活性（13个）、防御响应（9）、茉莉酸响应（6个）、花器官发育（6个）等功能组中包含的序列较多，水杨酸响应（5个）、细胞分化（4个）、盐胁迫响应（4个）、乙烯响应（4个）、脱落酸响应（4个）、赤霉素调控（3个）、锌离子结合（2个）、细胞壁生物发生（2个）、缺水响应（2个）、生长素响应（2个）、脱落酸激活信号通路调控（2个）、几丁质响应（2个）、对镉离子的响应（2个）、苯丙醇代谢过程的调控（2个）、茉莉酸介导的信号通路的调控（2个）、锌离子结合（2个）、水杨酸介导的信号通路调控（1个）、花药壁绒毡层发育（1个）、花粉精细胞分化（1个）等功能组中包含的序列较少。其中生物过程主要富集在细胞合成、生物响应和调控上，分子功能集中富集在结合和转录因子活性上，细胞组分主要富集在细胞核部分。综上所述，萼脊兰MYB转录因子通过结合到DNA区域发挥相应的调控功能，主要涉及植物的细胞过程、发育过程和物质代谢等过程。

2.5  萼脊兰MYB蛋白进化分析

为了研究萼脊兰MYB蛋白的进化关系并预测其功能，从PlantTFDB数据库中下载蝴蝶兰已有的11个MYB家族蛋白氨基酸序列，采用软件MEGA4构建萼脊兰MYB家族蛋白和蝴蝶兰MYB家族蛋白进化树。由图3可知，4个萼脊兰MYB家族蛋白分别与蝴蝶兰的MYB蛋白聚集在一起，5个蝴蝶兰的MYB蛋白聚在一起，且比较集中，说明萼脊兰MYB家族蛋白与蝴蝶兰MYB蛋白的保守性不是很高。

2.6  萼脊兰次生代谢相关MYB转录因子功能分析

通过构建萼脊兰MYB转录因子与蝴蝶兰所有MYB转录因子系统进化树，筛选同源性较高的蝴蝶兰MYB转录因子，然后分析MYB转录因子的分子功能。由表2可知，MYB转录因子基因TRINITY_DN38485_c0_g4_i2编码蛋白同源性较高的蝴蝶兰转录因子PEQU 10866，编码的蛋白为MYB8，推测其具有调控花色素沉积和参与调节类黄酮的生物合成的功能;TRINITY DN38485_ c0_g1_i1编码蛋白同源性较高的蝴蝶兰转录因子PEQU 23041，编码的蛋白为MYB6，推测其可能参与调节类黄酮的生物合成。TRINITY DN40180_ c3_g1_i1编码蛋白同源性较高的蝴蝶兰转录因子PEQU 05119，编码的蛋白为MYB10，推测其可能具有协调植物生长发育的功能;TRINITY DN43325 c1 g2 i2编码蛋白同源性较高的蝴蝶兰转录因子PEQU 30611，编码的蛋白MYB3，推测其可能具有抑制C4H基因表达的功能。

2.7  萼脊兰MYB转录因子基因表达分析

基于萼脊兰转录组数据，获得萼脊兰MYB转录因子在叶、花蕾、花朵各个组织的基因表达量，并绘制热图（图4）。从图4可见，MYB转录因子在组织表达模式上存在差异，大多数成员在叶、花蕾、花朵中均有表达，表达模式呈现多样化。萼脊兰MYB转录因子中10个MYB转录因子基因在花朵中的表达上调，5个MYB转录因子基因在花蕾中表达上调，12个MYB转录因子基因在叶片中的表达上调，而萼脊兰类黄酮的代谢产物主要在花朵和叶片中积累。萼脊兰MYB 转录因子TRINITY_ DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1基因均在花朵和叶片中表达量上调，根据表达模式分析：萼脊兰MYB转录因子TRINITY_DN38485_ c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1可能调节类黄酮的生物合成，这也与功能预测一致。

3  讨论

通过萼脊兰转录组数据分析，共筛选出55条MYB基因序列，片段大小为205～3982 bp。通过ORF预测全长氨基酸序列，发现27条序列具有完整的ORF。GO注释分析表明，萼脊兰27条MYB转录因子序列中分别有22、27、27条被注释到生物过程、分子功能和细胞组分。系统进化树分析发现，萼脊兰MYB家族蛋白与蝴蝶兰MYB蛋白的保守性不是很高。

类黄酮广泛存在于高等植物果实、花瓣和叶片等器官中，萼脊兰MYB 转录因子在组织表达模式上存在差异，在叶片、花蕾和花瓣中均有表达，表达模式呈现多样化。类黄酮的合成主要包括7个分支：花青素（anthocyanins）途径、原花青素（proanthocyanidins）途径、黄酮（flavones）途径、黄酮醇（flavonols）途径、异黄酮（isoflavone）和异类黄酮（isoflavonoids）途径、鞣酐（phlobaphenes）途径以及橙酮（aurones）途径[11-12]。预测萼脊兰MYB转录因子TRINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1可能通过黄酮途径调节类黄酮的生物合成。

除了对MYB蛋白功能的发掘，一些研究者还对其结构进行了深入研究，发现调控类黄酮合成的MYB转录因子大部分都是R2R3MYB转录因子[13]。蒋卉等[14]研究了蝴蝶蘭响应病毒关键MYB家族基因，发现152个MYB家族基因中R2R3型有138个。本研究通过对萼脊兰蛋白基序分析发现，27个MYB家族基因种21个基因属于R2R3-MYB类基因，大部分也都是R2R3型转录因子，两者研究结果一致。R2R3-MYB类4个转录因子AtMYB3、AtMYB4、AtMYB7和AtMYB32均为类黄酮的生物合成途径的抑制因子[15-17]。日本龙胆GtMYBP3和GtMYBP4基因在拟南芥中的异源表达激活了内源黄酮醇生物合成基因的表达，导致幼苗中黄酮醇积累增加[18]。在拟南芥中，较早发现并证实的调控类黄酮合成的MYB转录因子基因为AtMYB12[19]，同时，在其他物种中也发现了调控类黄酮合成MYB12的同源基因，如番茄SlMYB12[20]、龙胆花GtMYBP3和GtMYBP4[18]。萼脊兰RINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1同源的蝴蝶兰MYB 蛋白有MYB7，TRINITY_DN38485_c0_g1同源的蝴蝶兰MYB蛋白为MYB6和MYB4，同日本龙胆、龙胆、番茄和拟南芥的研究结果一致，说明萼脊兰的这3个预测的基因与类黄酮的生物合成密切相关。王雪霁等[21]研究发现39个PeMYBs基因在4种器官（根、茎、叶、花）中均表达，48个基因在不同器官中有特异性不表达现象，一些基因呈现器官特异性表达特点，与该研究萼脊兰MYB转录因子在组织表达模式上存在差异，大多数成员在叶、花蕾、花朵中均有表达，表达模式呈现多样化的结果一致。

参考文献

[1] Liu J Y， Osbourn A， Ma P D. MYB transcription factors as regulators of phenylpropanoid metabolism in plants[J]. Molecular Plant， 2015， 8（5）： 689-708.

[2] Xu F， Ning Y J， Zhang W W， et al. An R2R3-MYB transcription factor as a negative regulator of the flavonoid biosynthesis pathway in Ginkgo biloba[J]. Functional & Integrative Genomics， 2014， 14（1）： 177-189.

[3] Wang N， Xu H F， Jiang S H， et al. MYB12 and MYB22 play essential roles in proanthocyanidin and flavonol synthesis in red-fleshed apple （Malus sieversii f. niedzwetzkyana）[J]. The Plant Journal， 2017， 90（2）： 276-292.

[4] Liu C Y， Long J M， Zhu K J， et al. Characterization of a Citrus R2R3-MYB transcription factor that regulates the flavonol and hydroxycinnamic acid biosynthesis[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 25352.

[5] Huang W J， Khaldun A B M， Chen J J， et al. A R2R3-MYB transcription factor regulates the flavonol biosynthetic pathway in a traditional chinese medicinal plant， Epimedium sagittatum[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1089.

[6] 宋  楊， 刘红弟， 张红军， 等. 越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析[J]. 园艺学报， 2015， 42（12）： 2383-2394.

[7] Winkel-shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics， biochemistry， cell biology， and biotechnology[J]. Plant Physiology， 2001， 126（2）： 485-493.

[8] 李崇晖， 任  羽， 黄素荣， 等. 蝴蝶石斛兰花色表型及类黄酮成分分析[J]. 园艺学报， 2013， 40（1）： 107-116.

[9] 钟淮钦， 黄敏玲， 吴建设， 等. 蝴蝶兰花青素苷合成途径关键酶基因的克隆与表达[J]. 福建农业学报， 2013， 28（9）： 854-858.

[10] 张加强， 史小华， 刘慧春， 等. 基于转录组学的不同色系蝴蝶兰花色苷差异积累分析[J]. 分子植物育种， 2018， 16（14）： 4530-4542.

[11] Lai Y S， Li H X， Yamagishi M. A review of target gene specificity of flavonoid R2R3-MYB transcription factors and a discussion of factors contributing to the target gene selectivity[J]. Frontiers in Biology， 2013， 8（6）： 577-598.

[12] 伍小方， 高国应， 左  倩， 等. FtMYB1转录因子调控苦荞毛状根黄酮醇合成的机理研究[J]. 植物遗传资源学报， 2020， 21（5）： 1270-1278.

[13] 邢  文， 金晓玲. 调控植物类黄酮生物合成的MYB转录因子研究进展[J]. 分子植物育种， 2015， 13（3）： 689-696.

[14] 蒋  卉， 张  晶， 袁  欣， 等. 蝴蝶兰MYB家族基因鉴定及应对病毒的表达响应[J]. 分子植物育种， 2018， 16（21）： 6921-6930.

[15] Dubos C， Stracke R， Grotewold E，  et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15（10）： 573-581.

[16] Jin H， Cominelli E， Bailey P， et al. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis[J]. The EMBO Journal， 2000， 19（22）： 6150-6161.

[17] Fornalé S， Lopez E， Salazar-Henao J E， et al. AtMYB7， a new player in the regulation of UV-sunscreens in Arabidopsis thaliana[J]. Plant & Cell Physiology， 2014， 55（3）： 507-516.

[18] Nakatsuka T， Saito M， Yamada E， et al. Isolation and characterization of GtMYBP3 and GtMYBP4， orthologues of R2R3-MYB transcription factors that regulate early flavonoid biosynthesis， in gentian flowers[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（18）： 6505-6517.

[19] Mehrtens F， Kranz H， Bednarek P， et al. The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005， 138（2）： 1083-1096.

[20] Ballester A R， Molthoff J， De vos R， et al. Biochemical and molecular analysis of pink tomatoes： deregulated ex-pression of the gene encoding transcription factor SlMYB12 leads to pink tomato fruit color[J]. Plant Physiology， 2010， 152（1）： 71-84.

[21] 王雪霽， 梁立雄， 李潞滨， 等. 小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析[J]. 林业科学研究， 2018， 31（3）： 104-113.

责任编辑：黄东杰

收稿日期  2020-05-05;修回日期  2020-05-26

基金项目  河南省科技厅科技发展计划项目（No. 172102110227）;河南省科技攻关项目（No. 182102110357）;河南省重大科技专项（No. 701290）。

作者简介  蒋素华（1983—），女，硕士，副教授，研究方向：花卉分子生物学。*通信作者（Corresponding author）：崔  波（CUI Bo），E-mail：laocuibo@163.com。