不同方法提取的鹧鸪茶多酚抗氧化及抑菌性比较

段宙位　李鹏　何艾　王世萍　谢辉

摘  要：為筛选适合鹧鸪茶多酚的提取方法，在热水浸提法、有机溶剂浸提法和纤维素酶辅助浸提法提取鹧鸪茶多酚基础上，采用DPPH自由基法、ABTS自由基法、羟自由基法、超氧阴离子法和还原力法评价多酚提取物的抗氧化性;滤纸片扩散法和二倍稀释法测定多酚提取物的抑菌性。结果表明，热水浸提法、有机溶剂浸提法和纤维素酶辅助浸提法提取鹧鸪茶多酚的得率分别为（10.31±0.42）%、（9.79±0.38）%、（10.88±0.52）%;含量分别为（44.72±2.26）%、（39.54± 1.78）%、（47.07±2.52）%。3种方法浸提的多酚提取物均具有较强的抗氧化性，纤维素酶辅助提取的鹧鸪茶多酚（CFC）清除DPPH自由基能力最强，其半抑制浓度（IC50）为（0.0034±0.0002）mg/mL;热水浸提的鹧鸪茶多酚（WFC）清除ABTS自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基能力最强，其IC50值分别为（0.066±0.004）、（0.069±0.004）、（0.127± 0.009）mg/mL。3种方法浸提的多酚提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌均有较好抑制作用，其中WFC对4种细菌的抑制效果最好，抑菌圈直径依次为（12.34±1.01）、（12.16±0.95）、（2.12±0.15）、（6.12±0.36）mm，最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）依次为3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL。综合考虑，鹧鸪茶多酚提取采用热水浸提法较为适宜。

关键词：鹧鸪茶;多酚;提取;抗氧化活性;抑菌性

中图分类号：S326      文献标识码：A

Antioxidant and Bacteriostasis Activity of Flavanoid from Mallotus oblongifolius by Different Extraction Methods

DUAN Zhouwei1，2， LI Peng3， HE Ai1， WANG Shiping1， XIE Hui1*

1. Institute of Processing & Design of Agroproducts， Hainan Academy of Agricultural Science， Haikou， Hainan; 571100， China; 2. Collage of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China; 3. College of Animal Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： The aim was to select the suitable method for extracting the polyphenols from Mallotus oblongifolius. The polyphenols were extracted by hot water extraction， organic solvent extraction and cellulase-assisted extraction. The antioxidant activity of the extract density was evaluated by scavenging DPPH， ABTS， hydroxyl， superoxide anion radical and reducing force methods. The antibacterial activity of the polyphenol extracts was determined by filter paper diffusion method and double dilution methods. The yield of polyphenols by the hot water extraction method， organic solvent extraction method and cellulase-assisted extraction method was （10.31±0.42）%， （9.79±0.38）%， and （10.88± 0.52）%， respectively， and the content was （44.72±2.26）%， （39.54±1.78）%， and （47.07±2.52）%. The polyphenol extracts extracted by the three methods had strong antioxidant properties. The cellulose-assisted extraction of the polyphenols from M. oblongifolius （CFC） had the strongest ability to scavenge DPPH radical， and its half inhibitory concentration （IC50） was （0.0034±0.0002） mg/mL. The hot water-extracted polyphenols from M. oblongifolius （WFC） had the strongest ability to scavenge ABTS radical， hydroxyl radical， and superoxide anion radical， and the IC50 values was （0.066±0.004）， （0.069±0.004）， （0.127±0.009） mg/mL. The polyphenol extracts extracted by the three methods had a good inhibitory effect on four bacteria. Among them， WFC had a good inhibitory effect on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis and Pseudomonas aerugino， the inhibitory zone diameter was （12.34±1.01）， （12.16±0.95）， （2.12±0.15）， （6.12±0.36）mm， and the minimum inhibitory concentration （MIC） was 3.13， 3.13， 12.50， 6.25 mg/mL. Comprehensive consideration， the hot water extraction method is more suitable for the extraction of polyphenols from M. oblongifolius.

Keywords： Mallotus oblongifolius; flavonoids; extraction; antioxidant activity; antibacterial

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.033

鹧鸪茶[Mallotus oblongifolius（Miq.）Muell- Arg]系大戟科（Euphorbiaceae）、野桐属（Mallotus）植物的干燥叶，又称山苦茶，主要分布在中印半岛、苏门答腊岛[1-2]以及我国海南岛等地区，是海南一种具有浓郁地方特色的代茶饮料植物和药用植物。鹧鸪茶中含有多酚、多糖、氨基酸、蛋白质、苷类及萜类等多种营养物质[3-5]，具有镇痛、解油腻、助消化、抗氧化、抗衰老、利胆消炎、调节免疫等功效[6-8]。

近年来，随着区域特色农产品发展，鹧鸪茶的研究逐渐增多，主要集中在化学成分分析、活性测定及饮料开发上，如林连波等[9]研究了海南山苦茶挥发油成分;李彦军等[10]测定了鹧鸪茶提取物的抑菌活性;瞿兆蕙等[11]利用鹧鸪茶制作低能量凉茶饮料。多酚是具有多个酚羟基的次生代谢产物，具有抗氧化、抑菌、抗癌与抗动脉硬化等多种功效[12-16]。多酚常用的提取方法有熱水浸提法[17]、有机溶剂浸提法[18]、酶辅助提取法[19]、超声波辅助提取法[20]等，不同方法提取的多酚含量、种类和活性不一样。比较不同提取方法，筛选出适合鹧鸪茶多酚的提取方法，这对充分利用鹧鸪茶资源，提高其应用价值具有非常重要的意义。因此，本研究以鹧鸪茶为原料，在优化热水浸提、有机溶剂浸提和酶辅助提取鹧鸪茶多酚工艺基础上，测定提取物的抗氧化性、抑菌性，以期确定最佳的提取方法，为鹧鸪茶进一步研究利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  鹧鸪茶干粉：将2019年8月9日采摘于海南省文昌市铜鼓岭鹧鸪茶鲜叶（7～8成熟），洗净后50 ℃烘干，粉碎、过40目筛，制得鹧鸪茶干粉。

2，2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，纯度≥98%），上海生工生物有限公司;过硫酸钾、硫酸亚铁、铁氰化钾、邻苯三酚、三氯乙酸、H2O2、氯化铁均为分析纯，广州化学试剂厂;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，纯度≥99%），Sigma公司;没食子酸（纯度≥98%），北京索莱宝科技有限公司;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、绿脓杆菌（Pseudomonas aerugino）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），北京北纳创联生物技术研究院提供。

1.1.2  仪器与设备  CPA225D型电子天平，德国Sartorius公司;1800型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司;HZQ-211型恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-2D型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;YHSP-150型恒温恒湿培养箱，常州市天竟实验仪器厂。

1.2  方法

1.2.1  鹧鸪茶多酚的提取  （1）热水浸提法提取鹧鸪茶多酚。将鹧鸪茶干粉在温度80 ℃，料液比1∶20（g/mL）条件下，浸提2.0 h，过滤，得到鹧鸪茶提取液;55 ℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到鹧鸪茶多酚提取物（以下简称WFC）。

（2）有机溶剂浸提法提取鹧鸪茶多酚。将鹧鸪茶干粉用50%乙醇（V/V），在温度55 ℃，料液比1∶15（g/mL）条件下，浸提2.0 h，过滤，得到鹧鸪茶提取液;55 ℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到鹧鸪茶多酚提取物（以下简称OFC）。

（3）纤维素酶辅助有机溶剂提取鹧鸪茶多酚。将鹧鸪茶干粉在乙醇浓度50%（V/V）、温度55 ℃、pH 5.5、底物质量浓度40 g/L、纤维素酶添加量150 U/g条件下浸提2.0 h，过滤，得到鹧鸪茶提取液;55 ℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得到鹧鸪茶多酚提取物（以下简称CFC）。

1.2.2  鹧鸪茶多酚质量浓度的测定  参考段宙位等[18]方法，略有改动。将鹧鸪茶提取液稀释500倍，往1 mL稀释液中加入1 mL Folin-Ciocalteu和2 mL 15% Na2CO3溶液，混匀反应1 h后，于765 nm处测定吸光值。配制不同质量浓度没食子酸溶液，按上述方法测定吸光值，绘制标准曲线，y =34.286x+0.0332，R2=0.9967。根据标准曲线计算多酚质量浓度。

1.2.3  鹧鸪茶多酚得率与含量的测定  按照下列公式计算多酚得率与含量。

多酚质量（g）=（A₇₆₅?0.0332）×500×V/（34.286 ×1000）

式中：A₇₆₅为样液吸光值;500为样液稀释倍数;V为样液体积。

得率=m₁/m₀×100%

式中：m₁为多酚质量（g）;m₀为鹧鸪茶原料质量（g）。

含量= m₁/m₂×100%

式中：m₁為多酚质量（g）;m₂为鹧鸪茶多酚提取物质量（g）。

1.2.4  鹧鸪茶多酚提取物的抗氧化性测定  以蒸馏水为溶剂，将3种方法提取的鹧鸪茶多酚提取物配成不同质量浓度样品液，参考Cai等[21]方法测定DPPH自由基清除作用，Dinh等[22]方法测定ABTS自由基清除作用，朱淑云等[23]方法测定羟自由基清除作用，李花等[24]方法测定超氧阴离子自由基清除作用，段宙位等[18]方法测定还原力。

1.2.5  鹧鸪茶多酚提取物对细菌抑菌作用  采用滤纸片扩散法[25]，测量抑菌圈直径。制备浓度为106～108 CFU/mL菌液，取0.10 mL菌液，均匀涂布于LB培养基。将灭菌的直径6 mm圆形滤纸片于各多酚提取液中浸泡30 s后取出，置于培养基上。以无菌水作对照，37 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.6  鹧鸪茶多酚提取物的最小抑制浓度测定  采用二倍稀释法[26]，测定鹧鸪茶多酚提取物抑制菌株的最小抑制浓度（MIC）值。将不同质量浓度的鹧鸪茶多酚提取液添加到LB培养基中，摇匀，配成鹧鸪茶多酚提取物终浓度为50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL的培养基。取0.20 mL浓度为106～107 CFU/mL菌液，于培养基中37 ℃恒温培养24 h。以不含鹧鸪茶多酚提取液的LB培养基为空白对照，以无细菌生长的样液最低浓度为MIC。

1.3  数据处理

采用Excel 2007软件进行数据统计分析，Origin 8.5软件绘制图形。

2  结果与分析

2.1  不同方法提取的鹧鸪茶多酚得率与含量

同一原料，不同提取工艺，提取物得率和含量不一样。由表1可知，CFC中多酚得率和含量最高，OFC中多酚得率和含量最低，这可能是鹧鸪茶中多酚是多羟基类化合物，易溶于水和乙醇，利用纤维素酶辅助提取能促进鹧鸪茶中多酚溶出。WFC得率、多酚含量与CFC、OFC没有显著性差异;OFC得率、含量与CFC有显著性差异。

2.2  不同提取方法的鹧鸪茶多酚抗氧化性比较

2.2.1  清除DPPH自由基能力比较  由图1可知，不同方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对DPPH自由基均具有清除作用，清除率与提取物质量浓度呈量效依赖关系。这与Kwon等[27]报道，自由基清除能力与多酚质量浓度增加成正相关关系的结果一致。WFC、OFC、CFC和Vc清除DPPH自由基的半抑制浓度（the half inhibitory concentration， IC50）值分别为（0.0037±0.0003）、（0.0074±0.0004）、 （0.0034±0.0002）、（0.0057±0.0003）mg/mL，说明CFC清除DPPH自由基能力最强，WFC和CFC清除DPPH自由基能力强于Vc，OFC清除DPPH自由基能力弱于Vc。这可能是浸提物中起抗氧化作用的多酚化合物种类与含量不同，引起抗氧化性差异。

2.2.2  清除ABTS自由基能力比较  由图2可知，不同种方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对ABTS自由基均具有清除作用，清除率与提取物浓度呈量效依赖关系。WFC、OFC、CFC和Vc清除ABTS自由基IC50值分别为（0.066±0.004）、（0.137± 0.012）、（0.091±0.006）、（0.086±0.005）mg/mL，说明WFC清除ABTS自由基能力最强，强于Vc，CFC清除ABTS自由基能力与Vc相差不大。这与胡长玉等[28]等研究祁白术多酚清除ABTS自由基作用变化趋势相似，但其清除能力弱于祁白术多酚（其IC50值为0.050 mg/mL），这是因为不同植物中多酚种类与结构不同，表现出抗氧化性能力不同。

2.2.3  清除羟自由基能力比较  由图3可知，不同种方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对羟自由基均具有清除作用，清除率与提取物质量浓度呈量效依赖关系。WFC、OFC、CFC和Vc清除ABTS自由基IC50值分别为（0.069±0.004）、（0.118± 0.009）、（0.096±0.007）、（0.147±0.012）mg/mL，说明WFC、OFC、CFC清除ABTS自由基能力强于Vc，其中WFC清除ABTS自由基能力最强。WFC清除羟自由基的IC50值小于李花等[24]测定的鹧鸪茶水提物（其IC50值为0.0864 mg/mL），可能是原料产地、品种、叶片成熟度、采摘时间等多种因素差异引起。

2.2.4  清除超氧阴离子自由基能力比较  由图4可知，不同种方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对超氧自由基均具有清除作用，清除率与提取物质量浓度呈量效依赖关系。这与张秀芬等[29]测定辣木叶多酚超氧自由基作用变化趋势一致，但清除作用强于辣木叶多酚（IC50值大于5 mg/mL）。WFC、OFC、CFC和Vc清除超氧自由基IC50值分别为（0.127±0.009）、（0.182±0.015）、（0.152±0.074）、（0.392±0.026）mg/mL，说明WFC、OFC、CFC清除ABTS自由基能力强于Vc，其中WFC清除ABTS自由基最强。

2.2.5  还原力比较  由图5可知，WFC、OFC、CFC、Vc的还原力随提取物质量浓度增加而增加，还原力与提取物质量浓度呈量效依赖关系。这与魏园园等[30]测定栓皮栎橡子果仁多酚的还原力变化趋势一致，但在样品浓度0.04 mg/mL条件下，鹧鸪茶多酚提取物对Fe3+还原力更强。当WFC、OFC、CFC、Vc浓度为0.04 mg/mL时，对应的吸光值0.508±0.016、0.414±0.035、0.467± 0.016、0.788±0.018，说明还原力Vc>WFC>CFC> OFC。

2.3  不同方法提取的鹧鸪茶多酚抑菌性比较

2.3.1  不同方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对4种细菌的抑菌圈的影响  由表2可知，不同方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌均具有一定的抑制作用，不同提取方法对4种细菌的抑菌圈直径有影响，这可能是因为不同方法浸提的鹧鸪茶多酚中起抑菌效果的化合物种类与含量不同。WFC、OFC、CFC均是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，其对大肠杆菌抑菌圈直径依次为（12.34±1.01）、（10.83±0.62）、（11.52± 0.82）mm;对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径依次为（12.16±0.95）、（10.65±0.86）、（11.32±0.92）mm;对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最弱，其抑菌圈直径依次为（2.12±0.15）、（1.96±0.13）、（2.06±0.15）mm。OFC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径与李彦军等[10]测定的鹧鸪茶提取物相似（依次为11.00、10.80、2.10 mm）。

2.3.2  不同方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对4种细菌的最小抑制浓度  由表3可知，不同方法浸提的鹧鸪茶多酚提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌均具有一定的抑制作用，不同提取方法对4种细菌的MIC有影响。WFC、CFC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC均为3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL，说明WFC、CFC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强。WFC对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的MIC与李花等[24]测定的鹧鸪茶水提物（分别为3.13、6.25 mg/mL）相同。

3  讨论

目前关于多酚的提取方法较多，主要有热水浸提法、有机溶剂浸提法、酶辅助提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等，每种方法因操作方法与提取条件不同各有优势，得率、多酚含量等也有差异。本研究在前期优化热水浸提法、有机溶剂浸提法、酶辅助提取法工艺基础上，比较不同方法提取的鹧鸪茶多酚得率、含量、抗氧化性与抑菌性。根据结果，WFC、OFC、CFC得率分别为（10.31±0.42）%、（9.79±0.38）%、（10.88± 0.52）%;含量分别为（44.72±2.26）%、（39.54± 1.78）%、（47.07±2.52）%，CFC得率与含量最高，但只稍高于WFC，二者差异不显著，这可能是纤维素酶可在短时间内破坏细胞结构，进而增加细胞壁和细胞膜的通透性，利于多酚溶出;鹧鸪茶多酚可能是多羟基的酚类化合物，易溶于水，采用热水浸提法提取效果也较好。

自由基是一类瞬时形成含不成对电子的原子或功能基团。受控的自由基对人体有益，可以帮助传递维持生命的能量，杀灭病菌和寄生虫，参与毒素排出。但自由基过多或失控，便会氧化细胞膜、酶、DNA及蛋白质等物质，对机体造成损伤[31]。本研究测定3种方法提取鹧鸪茶多酚的5种体外抗氧化能力，得出CFC清除DPPH自由基能力最强，但其IC50值与WFC差别不大;WFC清除ABTS自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基能力及还原力最强，综合测定结果，WFC体外抗氧化性最强，其清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧阴离子自由基能力强于Vc，其IC50值分别为（0.0037±0.0003）、（0.066± 0.004）、（0.069±0.004）、（0.127±0.009）mg/mL，说明热水浸提法提取的多酚化合物具有良好抗氧化活性，可以应用于天然抗氧化剂领域。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为常见的致病菌，危害人体健康与食品安全;枯草芽孢杆菌为非致病菌，可用作处理工业和市政的污水，提高动物体内巨噬细胞和干扰素活性。研究以上具有代表性的致病菌与非致病菌，有利于客观评价鹧鸪茶多酚提取物的抑菌性。根据实验结果，3种方法浸提的多酚提取物对4种细菌均有抑制作用，其中WFC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌抑制效果最好，抑菌圈直径依次为（12.34±1.01）、（12.16±0.95）、（2.12±0.15）、（6.12±0.36）mm，MIC依次为3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL，说明鹧鸪茶多酚提取物的抑菌活性较为广谱，其对致病菌的抑制效果更好，非致病菌抑制效果弱，这与李花等[24]测定的鹧鸪茶水提物抑菌性结果一致。可以在保持非致病菌生长前提下，抑制致病菌的生长，这也利用鹧鸪茶的生产应用。考虑到CFC得率与含量稍高于WFC，二者差异不显著;WFC体外抗氧化性、抑菌性最强;WFC具有更低成本和更高食品安全性，鹧鸪茶多酚的提取采用热水浸提法较为适宜。

研究结果说明，热水浸提法提取鹧鸪茶多酚具有较强的抗氧化性与抑菌性，在食品抑菌防腐、天然抗氧化剂开发等方面具有广泛的应用前景，下一步对其抗氧化、抑菌性成分与作用机理以及实际应用等方面进行深入研究，以进一步提高鹧鸪茶的利用价值，也为鹧鸪茶在食品药品领域应用提供理论依据。

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责任编辑：崔丽虹

收稿日期  2020-03-28;修回日期  2020-05-13

基金项目  海南省自然科学基金项目（No. 319QN328）;2018年海南省农业科学院农业科技创新专项项目。

作者简介  段宙位（1985—），男，博士，副研究员，研究方向：营养与功能食品。*通信作者（Corresponding author）：谢  辉（XIE Hui），E-mail：790586793@qq.com。